小拟南芥HDG12基因克隆生物信息学分析及植物表达载体构建及植物表达载体构建.docVIP

小拟南芥HDG12基因克隆生物信息学分析及植物表达载体构建及植物表达载体构建 　　摘要：以小拟南芥基因组DNA为模板，运用同源克隆法获得小拟南芥HDG12基因，命名为ApHDG12。运用生物信息学方法，对ApHDG12基因的理化性质、保守序列、二级结构、亚细胞定位等进行了分析，并进行同源建模。经测序和生物信息学软件预测分析，结果显示，ApHDG12基因由10个外显子和9个内含子组成，mRNA长度为2 064 bp，编码687个氨基酸，亚细胞定位于细胞核。系统进化树显示ApHDG12与Capsella rubella遗传距离最近，CDD保守序列分析结果显示ApHDG12有18～79位的同源异型域和206～436位的START结构域，属于HD-zipⅣ类基因家族，同时构建了植物表达载体pBI121：：HDG12，转化到农杆菌GV3101中，为进一步研究基因功能奠定基础。 　　关键词：小拟南芥；HDG12基因；克隆；生物信息学 　　中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0033-05 　　收稿日期：2014-03-19 　　基金项目：石河子大学“自然科学与技术创新”团队项目（编号：2011ZRKXTD-0605）。 　　作者简介：梁志强（1988―），男，甘肃武威人，硕士，主要从事植物基因工程研究。E-mail：514326242@。 　　通信作者：王爱英，副研究员，主要从事植物基因工程与转基因生物安全性评价研究。E-mail：way-sh@126.com。全球正面临着水资源日益短缺的境况，由干旱造成的农作物减产及经济损失逐渐加剧，因此甄别利用具有耐旱性的基因，提高作物的耐旱性，发展生物节水农业，对于缓解水资源危机，保障国家的粮食安全、生态安全和可持续发展具有重要意义。 　　拟南芥HD-zipⅣ类基因家族有16个成员，其中大部分在植物表皮层中表达，控制表皮细胞的分化、色素的合成、表皮毛和根毛的发育[1-2]。GL2在表皮毛部位表达，控制种皮、根毛以及茎叶表皮毛的发育[3]；ATML1和PDF2共同调节表皮的发育，若PDF2过量表达则影响花的形态以及开花时间[4]；ANTHOCYANINLESS2（ANL2）控制表皮层花青素的积累[5]；HDG11基因过量表达则会抑制表皮毛的分叉，且HDG11和HDG12基因共突变时这种现象更为明显[1]，HDG11基因的过表达能够提高植物的耐旱性[6]。前人针对HD-zip基因家族的研究结果表明，该家族内成员的功能较为复杂，在植物生长发育的过程中均发挥着重要作用，因此更深层次的研究其基因家族内成员的功能并加以合理利用具有十分重要的意义。 　　近年来，对拟南芥近缘种的研究已成为一个热点，而新疆是拟南芥近缘种的分布中心[7]，小拟南芥（Arabidopsis pumila）是双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的近缘种，为十字花科拟南芥属的短命植物，在适应新疆特殊干旱气候方面，小拟南芥表现出更为优异的适应特性[8-9]。目前从小拟南芥中克隆得到了一些抗逆基因，与拟南芥有较高的同源性，如黄先忠等利用同源克隆法克隆的ApCBF1和AtCBF1编码的氨基酸序列一致[10]；院海英等利用同源克隆法得到的ApNHX1与AtNHX1编码的氨基酸序列比对结果为99%[9]；刘瑞娜等利用同源克隆法以AtHRD基因序列为模板设计同源引物克隆得到了小拟南芥ApHRD[11]。本研究以小拟南芥基因组DNA为模板，根据NCBI上HDG12基因序列设计同源引物，克隆得到了ApHDG12基因，并利用生物信息学软件及在线序列分析工具，对其进行结构与功能预测，以期为后续开展的ApHDG12基因功能和作用机理研究提供一定的参考依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　小拟南芥种子由本实验室保存，种植于“营养土 ∶蛭石=1 ∶2”的培养土中，置于20 ℃、16 h光照、8 h黑暗条件下培养。大肠杆菌TOP10、农杆菌GV3101，Taq DNA聚合酶购自天根公司，PMD18-T simple vector kit、琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1小拟南芥基因组DNA的提取采用CTAB优化法[12]提取小拟南芥基因组DNA。 　　1.2.2小拟南芥ApHDG12克隆及测序根据NCBI上已提交的拟南芥HDG12基因（NM_101655.2）cDNA序列，运用Primer 5.0设计同源引物（F：5′-AGTTGTGTGATGGTCCAGAGTTAGC-3′，R：5′-GATTTCTTACACTCTTTGCAGGCAT-3′），以小拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增，P