小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统制备及体外评价.docVIP

小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统制备及体外评价 　　【摘 要】目的：体外制备小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统，对其理化性质进行表征并观察载药系统对泡沫细胞存活率的影响。方法：利用乙醇注入-超声分散法制备辛伐他汀脂质体，借助胆酸钠介导载脂蛋白apoA-I与脂质结合，构建盘状重组高密度脂蛋白载药系统。对载药系统的理化性质进行表征，并进行MTT实验测定泡沫细胞存活率。结果：载药系统为40 nm左右的盘状，长轴方向上的直径在100 ～ 200 nm，盘的侧面高度在50 nm以下。药物包封率在80 %以上，载药量约为2.8 %，在4℃放置7天内稳定性良好。apoA-I与脂质结合后其α-螺旋含量上升，与脂质结合的稳定性有所提高。载药系统与泡沫细胞孵育后，细胞存活率有所升高。结论：体外成功制备了小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统，该系统对泡沫细胞的病理凋亡具有一定的治疗作用。 　　【关键词】 盘状重组高密度脂蛋白；辛伐他汀；载脂蛋白apoA-I；泡沫细胞 　　【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-00-01 　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种动脉壁的慢性炎症疾病，与冠状动脉疾病、心肌梗塞等多种血管疾病的发生有关[1]。巨噬细胞存在于AS的各个病理阶段，参与斑块炎症反应、纤维帽变薄、坏死核心形成及斑块破裂等多个病理过程[2，3]。因此，将巨噬细胞作为治疗AS的靶点具有重要的研究意义。 　　高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一种存在于血浆中的天然脂蛋白，直径在7～13 nm，由多种生物大分子组成[4，5]。载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）是HDL上含量最为丰富的蛋白成分，约占HDL蛋白含量的70 %。此外HDL上还包括一些其他的脂质成分，如胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯以及磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂等多种磷脂。HDL能够移除外周组织多余的胆固醇，递送肝脏进行代谢消除，这一过程即为胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）[5，6]，RCT被认为是HDL抗AS的主要机制[4]。此外，HDL还具有抗炎、抗氧化等多种生理功能[7]，同样能够起到抗AS的治疗作用。 　　目前，国内外已有学者体外制备重组HDL（reconstituted HDL，rHDL），具有与天然HDL相类似的组成、性质及结构，并具有良好的生物相容性、生物可降解性等优势，可将其作为化药[8]、基因[9]或造影剂[10]的载体。他汀类药物具有降血脂、抗炎抗氧化等?理效用，可用于抗AS。口服治疗剂量的他汀类药物主要在肝脏发挥降脂作用，若要达到抑制斑块的作用，则需要口服5 ～ 7倍的剂量[11]，如此会产生一定的肝毒性并伴随有肌病等一系列副作用。因此，将脂溶性他汀类药物载入rHDL中，可降低毒副作用，同时实现药物与载体抗AS的协同作用。 　　本实验室前期采用薄膜分散法制备载他汀类药物的rHDL[12]，该方法中使用的氯仿具有高毒性。本文以辛伐他汀（simvastatin，ST）作为模型药，采用乙醇注入-超声分散法制备辛伐他汀脂质体（ST loaded liposome，ST-liposome），避免采用高毒性有机溶剂，此外制备过程中不加入胆固醇，以尽量减少促AS发展的不良因素的引入。将脂质体与apoA-I蛋白样品孵育，得到小粒径辛伐他汀重组高密度脂蛋白载药系统（ST-loaded rHDL，ST-rHDL）。对制备得到的载药系统进行粒径、包封率（entrapment efficiency，EE）及载药量（drug-loading rate，DL）测定，以透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）观察其形态特征，并利用圆二色光谱（circular dichroism，CD）及盐酸胍（guanidine hydrochloride，Gdn-HCl）变性实验研究apoA-I的二级结构及其与脂质结合的稳定性，最后观察ST-rHDL对RAW 264.7巨噬细胞源性泡沫细胞存活率的影响。 　　1 实验材料 　　1.1 试剂 大豆磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司）；辛伐他汀原料药（上虞京新药业有限公司惠赠）；胆酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；Tris（生兴生物公司）；Sephadex G50（50-150 μm，瑞典pharmacia公司）；apoA-I蛋白样品（实验室从FIV沉淀中提取）；DMEM细胞培养基（维森特生物技术有限公司）；胎牛血清FBS