小麦品种高原115花青素合成代谢特点.docVIP

小麦品种高原115花青素合成代谢特点 　　摘 要：紫色籽粒小麦品种高原115已于2001年通过审定，并在中国西北春麦区进行示范推广，但目前关于该品种的花青素合成生理特性研究甚少。本研究以紫色籽粒小麦高原115和白色籽粒小麦opata为材料，通过对紫粒小麦高原115和白粒小麦在花青素类化合物化学组织、物质结构差异、籽粒发育过程中花青素含量的变化以及对外界环境反应的研究，从而了解高原115紫色籽粒中花青素合成的特点，更好地利用现有品种，为克隆小麦紫色籽粒花青素合成的关键基因打下基础。 　　关键词：紫粒小麦；高原115；花青素；合成代谢 　　花青素是一种植物特有的水溶性色素，是植物中重要的次生代谢产物。目前，育种家们已从小麦中选育出了几种不同籽粒颜色的小麦（红、紫、黑、蓝），但对其色素形成的代谢途径及遗传机理尚不清楚。本研究的目的是以紫色籽粒小麦品种高原115为主要试验材料较为系统地分析控制小麦籽粒中花青素积累的生理机制。 　　光是影响花青素合成与积累的主要因素之一，它主要从影响植物的形态建成和生长代谢以及通过激活花青素代谢过程中的调控酶类，以促进花青素的合成。 　　采用冰冻切片，对紫色籽粒小麦品种高原115花青素的化学组织进行定位，发现高原115籽粒的花青素定位于果皮和种皮。利用HPLC技术，从高原115籽粒中分离得到五种不同的花青素类化合物，测定高原115与Opata（白粒小麦）开花后籽粒中花青素含量的变化。结果发现高原115籽粒中花青素含量高于Opata（白粒小麦）。高原115籽粒中花青素合成开始于开花后14天，到开花后28天籽粒中花青素含量达到最大。通过研究光对开花后不同时期籽粒花青素合成的影响，揭示了光在高原115紫色籽粒花青素合成中的作用。结果表明光对高原115籽粒的花青素合成具有诱导作用，并影响成熟籽粒的花青素含量。 　　一、材料与方法 　　1.材料 　　紫色籽粒小麦高原115由中国科学院西北高原生物研究所选育并提供；Opata 由International Triticeae Mapping Initiative（ITMI）惠赠。 　　2.实验方法 　　（1）冰冻切片。将样品室的温度调整到-20℃并切割样品到合适的大小，激活Peltier，静置40秒至制冷机达到最大制冷输出，室温条件下将足够的cryocompound添加到样品盘上，将样品盘置于快速冷冻架上，使样品冷冻至低温。样品在冷冻过程中，首先将从周边开始变白，直至中央留下绿豆大小的反光区，并且会很快随之消失。此时可将样品盘插入至切片机的样品孔中，在切样之前应先将手轮的手柄锁死，然后用刀的安全挡板挡住刀刃，且拧松样品头的螺丝。将样品盘的柄插入到样品头的定位孔，需保证样品盘的柄彻底插入到样品头的孔中，且与样品头充分接触，拧紧螺丝，将刀插入刀架，且需夹紧刀片；调整刀架上的角度至2℃且调整刀架，使其与样品相对，除去安全挡板，解锁手轮，旋转手轮将样品修正到合适的大小。将切片厚度调整至15?m，匀速转动手轮进行切片。将完整的切片用毛笔挑取至样品室预冷的载玻片上，滴入甘油，盖上盖玻片，置于Laica显微镜下观察。 　　（2） 花青素含量测定。 　　①花青素提取。将单粒种子置于2.0 mL离心管中，加入1 mL 0.1% HCl-methanol （12N HCl ： 99.9% MeOH 1 ： 35），4°C，静置48小时后，于13000rpm离心15 min，吸取上清（500 ?l），用于花青素含量测定。 　　②标准溶液。称取花青素1 mg （Sigma，43725），并加入0.1% HCl-methanol溶解，定容至25 mL。配成标准溶液，分别精密吸取标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10mL并分别置于10 mL容量瓶中，以0.0 mL为空白，分别置于其最大吸收处测定吸收度，以吸收度（A）对浓度（C， ?g/mL）进行线性回归，得到线性回归方程。 　　③样品测定。为了补偿叶绿素对花青素含量测定的影响，花青素含量计算用公式：A530 -（0.25 × A657）（Hasegawa et al. 2001）。 　　（3）高效液相色谱（HPLC）。 　　① 样品提取。利用液氮将样品冰冻，并进行研磨至变成粉末，加入500 ?l 0.1%盐酸/甲酸溶液，室温震荡器24小时，12000rpm离心20 min，吸取上清，0.45 ?m纤维滤膜过滤。4°C保存。 　　② 仪器及色谱条件。高效液相色谱分析在WATERS515，监测器为WATERS2996PAD，?稻菔占?和分析是在WATERS工作站下进行（分离柱：C18 反相柱；流动相：1%甲酸（A）和色谱级甲醇（B）；进样量：20 ?l；高压限制：4000；开始波长： 190 nm