中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力分析-genotyping and virulence analysis of toxoplasma gondii strains from cats in southwest china.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文 安徽医科大学硕士学位论文 3.2 小鼠毒力…….……………………………23 4 讨论…………………………………………………………………...24 5 结论…………………………………………………………………...27 参考文献………………………………………………………………….28 附一（个人简历）.………………………………………………………31 附二（致谢）.……………………………………………………………32 附三（综述）…..…………………………………………33 - - PAGE 1 - 英文缩略词汇表 英文缩写 英文全称 中文全称 DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 bp base pair 碱基对 PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism 聚合酶链式反应 限制性内切酶片段长度多 态性 SAG surface antigen 表面抗原 ROP rhoptry 棒状体蛋白 PBS Phosphae Buffered Saline 磷酸盐缓冲液 AMP Ampicillin 氨苄西林 STR Streptomycin 链霉素 rpm revolutions per minute 每分钟转速 EB ethidium bromide 溴化乙锭 ICR Institute for Cancer Research 美国国立肿瘤研究所 DEPC diethypyrocarbonate 焦炭酸二乙酯 中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力研究 硕士研究生： 孟德娣 导 师： 沈继龙教授 安徽医科大学病原生物学教研室、安徽病原生物学省级实验室、人兽共患病安徽 省重点实验室（安徽医科大学） 摘 要 目的 研究流行于我国西南地区（贵阳）猫源弓形虫株基因型分布及其毒力。探 讨其与中国其他地区有无遗传差异，以及分离株对不同品系小鼠的毒力。 方法 从中国西南地区（贵阳）收集猫的标本进行动物接种，分离虫株，收集小 鼠腹水中的速殖子进行提取 DNA，经 PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）， 在 SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1 和 Apico 十个位 点进行基因分型；反应总体积为 50 μl，其中 PCR master mix 25 μl、上下游 引物各 1 μl、DNA 模板 1.5 μl。扩增条件为 94℃预变性 5min，然后 94℃变性 30s，60℃退火 60s，72℃延伸 90s，循环 35 次，最后 72℃延伸 10min。反应结束 后，每管取 5μl PCR 产物在含溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）的 1%琼脂糖凝 胶中 100V 电泳 30min，并在凝胶成像仪中观察结果。然后各管余下 PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳 PCR 产物用相应的内切酶酶切。酶切后产物经 2.5%琼脂糖凝胶 电泳，0.5μg/ml 溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统中观察电泳图谱，并与参考虫 株图谱进行对比。经 PBS 稀释的纯化速殖子按 1?103 个/只腹腔感染 SPF 级 KM， BALB/c，C57BL，ICR 小鼠，每组 10 只。逐日观察小鼠状态并计算死亡率和存活时 间，进行毒力分析。 结果 采用 10 个遗传位点，从贵阳分离出 2 株弓形虫株，经 PCR-RFLP 分析揭示 了 1 个基因型（ToxoDB#9, China 1）。基因型 China 1 型在 SAG2、GRA6、L358、 PKl、c22-8 位点为基因 II 型；在 SAG3、BTUB、c29-2 位点为基因 III 型；在 Apico 位点为基因 I 型。BALB/c、C57BL、KM 、ICR 四个品系雌鼠各 10 只，经腹腔接种 1×103 个 CT-1 虫株速殖子。C57BL 小鼠感染后第 5 天开始出现竖毛、腹水、抽搐 等明显症状甚至死亡，第 6 天完全死亡。BALB/c 小鼠在第 5、6、7 这三天之内全 部死亡。KM 小鼠感染后 6-7 天，活动减少，出现弓背、竖毛等症状，第 10 天死 亡 2 只小鼠，感染后第 15 天至观察 45 天结束，小鼠恢复正常活动，一直存活。 ICR 小鼠相对于 BALB/c、C57BL 小鼠症状轻微，在第 10、14 天分别死亡了 2 只和 1 只小鼠，其余的在 45 天内存活。存活的感染小鼠 45 天后颈椎脱臼处死，脑组织 压片发现有大量包囊形成。通过进行不同品系小鼠毒力研究显示：CT-1 虫株感染 C57BL、BALB/c、KM、ICR 小鼠死