猪乙型脑炎病毒rtpcr检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株prme基因的序列分析-establishment of rt pcr detection method for porcine japanese encephalitis virus and sequence analysis of prme gene of japanese encephalitis virus sichuan isolate.docxVIP

喇喇 喇喇唰mMM 川川川吨， 阳阳肌肉，h 唰MMdE 唰唰唰AU 川川MOO 阳配UUA1· 恻恻Y 本人郑重声明:所里交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标性和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一向工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生蜘咐: 均年 4月纱日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留井向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印成扫描 等复制手段保存、汇编学位论文.同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容. 研究倒: 步制 名:0(ω叼 3物年 d月2卢日 年月日 中文摘要 乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严意威胁人商健康的急性传染病。猪 是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主，乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给 我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒 RT-PCR 诊断方法并 对分离自四川崇州猪场和内江猪场的蚊源乙脑病毒 (CZ1 株和 NJ1株)进行 PrM/巴 基因的序列分析，从分子水平上了解四川乙脑分离毒株的生物学特性，对皿 V 的诊 断、预防和控制具有较大的意义。 1.猪乙型脑炎病毒盯:PCR 检测方法的建立 参考 GenBank 中收录的 31 株 JEVE 基因序列，进行相似性分析，以 SAI4-14-2 为参照确定区段为扩增靶序列;用 Primer 5 软件合成了一对引物 (PIIP2) ， 产物长度为 439忡。对试验的 Mi+浓度、引物浓度、退火温度等反应条件进行优化、 选择。确定了 PT-PCR 扩增最佳体系为: 10xbuffer (Mi+-Free) 5此， 25时1Mgμ2.。此， 2.5mM dNTP 4此， 1Opmol 上下游引物各 0.8此， 5U I L]叫DNA 聚合酶 0.5阵，DNA 模板 1μ1，最后用无菌去离子水补至 50μLoPCR 扩增程序如下: 94C-5min; 94C-30S ， 56C30 S，72 C 40 S，30 个循环; 72.C 延伸 10 min ，4C 保存。 R下PCR 特异性检 测试验表明，该方法对常见的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、 猪细小病毒扩增均无条带;敏感性检测显示，能最低检测到 10pg 的 JEV 核酸。结果 表明建立了 RT-PCR 检测 JEV 方法，具有简单、快速、特异性好、灵敏性高等优点。 2. 四川乙脑分离株 CZl 株、 NJ1株 PrM/E基因的序列分析 来用 R下PCR 扩增并克隆分离株的 PrM/E区段序列，利用 PrM (456-695 位)区 段序列与 29 株参考序列进行基因分型分析，并对巴区段核背酸序列与减毒活疫苗株 SA14-14-2 的相应序列进行比对，分析 CZl 株、 NJ1株与 SAI4-14-2 氨基酸的相似性 及关键结构域的差异。 结果表明， CZl 株 PrM (456-695 位)区基因分型证实分离株属于基因 I型， E 区段与 SA14-14-2 的核昔酸与氨基酸相似性分别为 90.9%和 97.2% ，但在巴蛋白的活 性关键结构域有 15 个氨基酸存在差异; JEV-NJ1株 PrM (456-695 位)区基因分型 证实分离株属于基因囚型， E 区段与 SA14-14♂的核背酸与氨基酸相似性分别为 99.6%和 99.2%，但在巴蛋白的活性关键结构域有3 个氨基酸存在差异;本研究初步 -11- -11- 确定了 CZl 株和 NJ1株的部分分子特征，对乙脑的流行病学研究及其防治具有重要 意义。 关键词t 猪乙型脑炎 ;R丁:PCR; PrM 基因;基因型 ;E 基因 ? ?111- Establishment of R下PCR detection method for porcine Japanese encephalitis virus and JEV isolated from Sichuan PrMIE gene sequences analysis Wang weijie (Preventive Veterinary Medicine) Directede by Professor Wen Xintian and Professor Cao S叫ie Abstract Japanese encephalitis is one