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徐长卿提取物对损伤内皮细胞中乳酸脱氢酶肿瘤坏死因子及白细胞介素8活性影响 　　[摘要] 目的 研究徐长卿提取物对损伤内皮细胞中炎症介质乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子（TNF-α）及白细胞介素-8（IL-8）活性的调节作用，探究徐长卿治疗动脉粥样硬化的作用机制。 方法 应用补体蛋白纯品于体外在人脐静脉内皮细胞表面组装亚溶破剂量的C5b-9，建立内皮损伤模型，分别建立提取物高、中、低剂量组及空白、模型及标准品对照组，分别用不同浓度的徐长卿提取物及丹皮酚标准品处理细胞，应用紫外分光光度法及ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中LDH、TNF-α及IL-8浓度。 结果 提取物高剂量组LDH[（119.85±4.12）U/L]及IL-8[（33.65±2.48）ng/L]与模型对照组[（200.49±3.31）U/L，（40.98±0.60）ng/L]比较，差异有高度统计学意义（P 0.01）；高剂量[（94.75±3.19）ng/L]及中剂量组[（92.81±1.78）ng/L]与模型对照组[（108.00±2.30）ng/L]比较，均可降低TNF-α水平（P 0.01）。 结论 徐长卿可能通过降低炎症介质LDH、TNF-α及IL-8活性，从而修复内皮细胞损伤来达到治疗动脉粥样硬化的目的。 　　[关键词] 徐长卿提取物；乳酸脱氢酶；肿瘤坏死因子；白细胞介素-8；攻膜复合物C5b-9 　　[中图分类号] R961.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（a）-0010-03 　　徐长卿为萝藦科多年生草本植物，《太平圣惠方》记载，徐长卿具有化瘀散结，降脂通络等作用[1]。临床上用于调节血脂代谢紊乱，降低血脂、防治心脑血管动脉硬化[2]。攻膜复合物C5b-9的过度活化引发的内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化发生的主要原因[3]，前期实验研究已确定了导致内皮细胞损伤的C5b-9临界浓度，即C5b-9的亚溶破剂量，本文旨在研究徐长卿提取物对损伤内皮细胞中炎症介质活性的调节作用，探究徐长卿治疗动脉粥样硬化的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　HUVEC（上海青忠贸易有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），RPMI1640培养基（Hyclone公司），补体C5b-6、C8、C9（德国Merck公司），补体C7（美国Sigma公司），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、白细胞介素-8（IL-8）试剂盒（南京建成），徐长卿药材（购自吉林大药房），丹皮酚标准品（北京药品生物制品检定所），标准酶标仪（美国Thermo公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 徐长卿药材有效成分提取 称取徐长卿药材适量，置于圆底烧瓶中，加入适量50%乙醇溶液，回流提取2 h，待提取液冷却后二次回流提取1 h，放冷过滤，经冷冻干燥后，得到药材冻干粉。 　　1.2.2 内皮细胞损伤模型的建立[4-7] 前期应用激光共聚焦显微技术已确定了导致内皮细胞损伤的C5b-9的临界浓度，现将该浓度的C5b-9组装于内皮细胞表面，具体过程如下：用2.5 mg/L的胰蛋白酶消化分离细胞，预热无血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，1000 r/min，离心5 min。加入纯品C5b-6（1.6 mg/L，1 mL）和C7（10 mg/L，1 mL），置于37℃孵育1 h。RPMI 1640洗去未结合的补体成分，加入C8（10 mg/L，1 mL）和C9（10 mg/L，1 mL），置于37℃孵育1.5 h。RPMI 1640洗去未结合的补体，将组装好的细胞接种于96孔细胞培养板中（每孔接种1.5×104细胞），置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育1 h，使细胞稳定。 　　1.2.3 提取物对损伤细胞的作用 分别称取适量药材提取物冻干粉及丹皮酚标准品，用PBS缓冲溶液配制成高、中、低浓度溶液，分别用以上药物处理细胞，同时设立空白对照及模型对照组。处理后细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育96 h，收集细胞培养上清液。 　　1.2.4 测定上清液中各炎症介质的活性 按照试剂盒说明书，分别测定收集的上清液中LDH、TNF-α及IL-8的活性。 　　1.3 统计学方法 　　采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　细胞培养上清液中各炎症介质的分泌水平见表1。由表1可知，徐长卿提取物高剂量组及中剂量组与模型对照组比较，LDH、TNF-α及IL-8分泌水平差异均有高度统计学意义（P 0.05）。丹皮酚标准品对照组与实验组结果基本