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微流控PCR芯片研究进展 　　摘 要 基因是人类的遗传密码，人类个体之间只有万分之一的基因不相同，却导致了人与人之间丰富的差异。了解这种差异对于科学研究具有巨大的应用价值。PCR是基因研究中常用的手段之一，但传统PCR仪存在反应时间长、能量消耗大、不便于集成与携带等缺陷，微流控技术与PCR结合可以有效缩小反应体系，提高反应效率，且易于集成化与微型化。本文按照微流控PCR芯片的结构分类， 详细介绍了微池型、连续流动型PCR芯片，以及电泳、荧光、电化学和DNA杂交阵列等检测方法，并在最后进行了总结与展望。 　　关键词 微流控； 聚合酶链式反应； 芯片； 综述 　　1 引 言 　　2001年2月12日，中、美、日、德、法、英等国科学家和美国赛莱拉公司公布了人类基因组图谱和初步分析结果[1]。这是人类对自身奥秘的探索史上一个重要的里程碑。研究结果显示，人类99.99%的基因是相同的，仅万分之一的不同基因造就了个体间丰富的差异。了解这种差异对于基础生物学和医学等方面研究都具有巨大的应用价值。 　　在基因研究中，聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种常用手段。PCR技术最先由Mullis等在1985年发明[2]，并获得了1993年的诺贝尔化学奖[3]。PCR的过程包括3个步骤：变性、退火、延伸，需要在高低中3个不同的温度（高温变性：90℃～95℃，低温退火：55℃～60℃；中温延伸：70℃～72℃）下进行。除了反应区域温度的调节，实验中还涉及到反应物、酶、DNA模板溶液体积的精准测量，反应体系的混合，溶液的驱动和控制等。传统的PCR仪器中的反应是通过样品槽反应管样品之间的热传递实现的，存在反应时间长、反应体积大、能量消耗多、易产生副产物、不便于集成与携带等缺陷。 　　微流控（Microfluidics）是一门在μm～mm尺度下研究流体的处理与操控的技术[4]，集成化的微流控芯片还可以将采样、稀释、反应、分离、检测、分析等多个步骤融为一体，已广泛用于化学、生物等各领域。本实验室对于微流控芯片在化合物分离检测[5]、药物筛选[6]等方面的应用均有研究。利用微流控芯片，传统PCR仪存在的各种问题都有了解决的可能。例如：微小的反应体系可以使热传递更迅速，显著提高扩增速度，同时避免非特异性扩增，提高反应效率；全封闭的体系可以减少频繁的手工操作引入的样本污染和溶液损失；系统微型便携，利于现场实时检测等。 　　2 微流控PCR芯片 　　用于制作微流控芯片的材料有硅、玻璃、石英、金属和有机聚合物如环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）等[7]。其中，硅和玻璃具有良好的化学惰性和热稳定性，与硅相比，玻璃的机械强度更高，是制作PCR芯片的主要材料。PDMS生物相容性好，可塑性强，并且PDMS表面与很多材料表面都有很好的亲和力，易于实现可逆封装，可以用于制作生化分析器件[8]。但是PDMS的导热系数小，散热性差等特性在某些情况下不利于PCR反应的进行，可以与热传导性能好的玻璃形成混合芯片结构，同时改善PCR芯片的散热和光学性能。 　　除了利用软光刻技术对微流体通道进行微细精密的加工[9]， 还可使用热压法、注塑法和激光烧灼法等传统方法以及3D打印等新兴手段制作芯片。微通道封装时，采用等离子表面处理或深紫外照射[10]后，迅速贴合，可以得到牢固和永久的封装。 　　根据芯片的结构差异可将PCR芯片分为静止PCR与动态PCR，或微池型PCR（Microchamber PCR， MCPCR）与连续流动PCR（ContinuousFlow PCR， CFPCR）。微池型PCR的特点在于，反应体系不流动，通过芯片整体升温降温的循环来实现反应；连续流动PCR则由反应液体循环流过不同温区进行扩增。在连续流动型PCR芯片中，反应溶液沿着微通道在3个固定的温度区连续流动，3个温度分别对应高温变性区、低温退火区和中温延伸区，在每个温区的流动时间和速度决定了反应时间。每流过3个温区为一次循环，PCR溶液按照所需的循环数依次流动，最后完成整个扩增反应。 　　2.1 微池型PCR芯片 　　微池型PCR芯片是传统PCR的微型化，有单反应池[11～15]，液滴虚拟微池[16，17]及微池阵列[18～22]3种设计。 单反应池结构简单，1993年由Northrup等[11]首次报道，他们在硅基质上刻蚀出空腔，加入50 μL反应液进行PCR扩增。Giordano等[12]在2001年采用聚酰亚胺材料制作单池PCR芯片（如图1A所示），利用红外加热，在4 min内完成了对长度为500 bp的DNA片段的扩增。Neuzil等[16]采取以矿物油包裹PCR溶液的方式，形成了液滴虚拟微池来