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微生物发酵法制备乳清抗氧化肽研究 　　摘要：目前国外对发酵法生产乳清蛋白抗氧化肽进行了研究，而国内在这一领域的研究则未见报道。采用微生物法制备生物活性肽，微生物发酵过程中产生的蛋白酶可以降解蛋白质，将蛋白酶的发酵生产和乳蛋白肽的酶解生产结合在一起，大大降低了乳蛋白肽的生产成本，有更好的应用前景。 　　关键词：乳清抗氧化肽 氧自由基清除率 水解率 　　生物活性肽，是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，近年来，对乳源性生物活性肽构效关系方面的研究进展迅速，乳蛋白被裂解成小分子肽后具有特殊的生物学功能，研究发现乳清蛋白水解物也其有多种药理及活性功能，如降血压【1】、抗血栓【2】、降胆固醇【3】，免疫调节【4】等。 　　一、制备材料与方法 　　1.1制备材料 　　脱盐乳清粉，脱脂奶粉，茚三酮、果糖、三氯乙酸、氯化纳、琼脂、酵母粉、葡萄糖、醋酸钠、硫酸镁、硫酸锰、茚三酮、果糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、甘氨酸等试剂均为国产。 　　1.2菌株 　　植物乳杆菌A9，东北农业大学食品学院提供；保加利亚杆菌L6、嗜热链球菌S21、嗜热链球菌S1、保加利亚杆菌L34.5、嗜热链球菌SP1.1，哈尔滨工业大学食品科学与工程学院提供。 　　1.3培养基 　　MRS培养基；牛肉膏10g/L，蛋白10g/L，酵母粉5g/L，，葡萄糖20g/L，，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温80 0.1g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.28g/L（均为质量浓度），PH值为6.2-6.4。 　　脱脂乳培养基为脱脂奶粉（质量浓度为11g/L）。 　　1.4方法 　　1.4.1菌种活化 　　A9接入MRS液体培养基，37℃静止培养36h活化；L34.5、L6、SP1.1、S1、S21接入脱脂乳培养基，37℃静止培养10h活化。 　　1.4.2乳清蛋白的酶法水解工艺流程 　　乳清粉一复原（100%）―105℃灭菌15min―接菌―静止培养―沸水浴加热10 min钝化酶―测水解度―400rpm，20min离心取上清液―测抗氧化活性 　　1.4.3乳清的发酵实验 　　乳清粉按10%复原后，在105℃下灭菌15min，冷却后接入菌种，置于培养箱中静止发酵，研究菌种、菌种比、发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH值对乳清发酵生产抗氧化肽的影响，并优化发酵工艺。 　　1.4.4乳清多肽抗氧化活性测定 　　采用邻苯三酚自氧化法测定【5】。在试管中依次加入4.5ml 0.1mol/L（pH8.2，内含2mmol/L EDTA）缓冲溶液，4.2mL双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的0.33mL 3mmoL/L邻苯三酚溶液（以10mmoL/L HCL配置，对照管用10mmoL/L盐酸代替），迅速摇匀，立即倾入比色皿中，在波长325nm处每30s测定一次吸光值A，计算线性范围内每分钟A的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率A0。乳清抗氧化肽活性测定按上述操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量样液，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为A1。清除率/%=A0-A1/A0*100% 　　1.4.5水解度（DH）的测定 茚三酮显色法 　　（1）标准曲线的绘制。采用茚三嗣法进行测定绘制标准曲线【6】。 　　茚三酮显色剂的配制：茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HP04?1OH20 10g，KH2PO4 6g，定容至100mL。 　　（2）水解蛋白液中-NH2基的测定 　　取离心液0.5mL定容至50mL，取0.4mL稀释液于试管中并加入1.6mL蒸馏水、1mL显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min，同时作空白实验，以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2的浓度（mmol/L）。DH/%=（水解后-NH2含量-水解前-NH2含量）/6.25*100%。式中：htot为每克蛋白质的肽键毫摩尔数，查得乳清蛋白htot=8.8（mmol/g）；6.25N为水解底物蛋白质质量浓度（g/L）测得为11.66。 　　1.4.6肽含量测定 　　用三氯乙酸可溶性氮含量来反映肽的含量。取10mL发酵后的离心上清液于离心管中，加入lOmL 20%的TCA溶液，混匀后400rpm离心20min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量【3.15】。 　　二、实验结果与分析 　　2.1水解度（DH）计算 　　2.1.1标准曲线的确定 　　本研究采用水和茚三酮法测定水解蛋白质的水解度，按照标准曲线绘制的方法制，结果如图2-l所示。 　　图2-1 不同质量浓度甘氨酸溶液A-C关系曲线 　　2.2乳清发酵菌种的选择 　　2.2.1单菌培养对乳清蛋白水解度和发酵产物氧自由基清除率的影响 　　图2-2单菌