拟南芥缺失突变体at14a比较转录组分析.docVIP

拟南芥缺失突变体at14a比较转录组分析 　　摘要：以at14a相关基因型（野生、缺失）拟南芥植株为试验材料，利用转录组学和生物信息学等方法，分析野生型（col）、缺失突变体（at14a）拟南芥差异基因表达状况，初步探讨拟南芥AT14A的功能。结果表明：at14a在拟南芥植株根、茎、叶和花中均有表达，尤其在叶片中的表达量较高；相较于野生型，缺失突变体at14a中有194个差异基因，其中上调基因122个，下调基因72个；通过GO富集分析发现，2种基因型植株差异基因主要参与了应答胁迫过程，这表明at14a可能通过调控AT5G39610、AT1G53240、AT4G32770、AT1G02920、AT1G10760这些逆境胁迫相关基因的表达来参与应答胁迫。差异分子主要定位于细胞核，具有绑定的分子功能。通过pathway分析发现，2个基因型植株差异基因主要参与了核糖体代谢、碳水化合物代谢、光合等代谢途径。研究结果为深入研究at14a作用的分子机理奠定了基础。 　　关键词：AT14A；拟南芥；缺失突变体；基因芯片；转录组学 　　中图分类号：S188；Q786 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0070-04 　　植物细胞壁可能与膜蛋白相互作用，其中一类膜蛋白就是与动物细胞整合素蛋白相似的类整合素蛋白。整合素是动物细胞黏附分子的重要成员，属于一类跨膜蛋白的超家族，是由2个跨膜糖蛋白亚基（α、β）通过非共价键连接而成的异二聚体，它们黏附于细胞外基质（ECM）并结合细胞骨架。整合素分子的结构特点使其成为动物细胞内外信号双向转导过程中的关键分子之一，它能介导细胞膜双向信号转导，即通过调控细胞外的信号从而调控其与细胞外配体的结合活性；同时，细胞外基质与整合素的结合诱导细胞内的信号传递过程。整合素在多种生理活动中具有重要的功能，它们调节细胞的迁移、极性、生长、分化，并与基因表达的信号转导元件相互作用[1-3]。在植物中，整合素尚未被证实，有可能是因为植物已经将这些蛋白功能以不同于哺乳动物细胞的方式进行组合，以适应植物质膜的独特结构，并与细胞壁相互作用[4]。自从Schindler等首次发现与动物整合素具有相似功能的类整合素蛋白以来，在植物中已经确定了许多类整合素蛋白[5-6]。 　　Nagpal等在1999年报道了在拟南芥cDNA库中用抗脊椎动物整合素β1亚基胞内高度保守结构域抗体作探针分离和鉴定出1个与整合素具有部分相似序列的cDNA克隆――AT14A，这为植物类整合素的存在提供了直接证据。AT14A（At3G28300）编码基因有1个1 154 bp的开放阅读框，只存在1个外显子，由1 459个核苷酸组成，其中10至1 164位核苷酸组成编码385个氨基酸的蛋白，分子量预测为43 ku。序列分析发现，AT14A蛋白有1个小的结构域与真菌、昆虫和人类的整合素存在序列相似性，并有1个编码11个氨基酸的高度保守区，它与人类D1整合素胞内结构域同源性较高[7]。笔者前期研究表明，拟南芥AT14A蛋白功能类似于动物中的整合素，介导了悬浮细胞细胞壁-质膜-细胞骨架连续体（WMC）的连接[8]。然而，关于AT14A发挥生理功能的机制尚不清楚。 　　转录组学是新兴的研究细胞表型和功能的重要手段，在研究基因结构、表达和功能上开拓了新型研究方向。转录组（transcriptome）概念最先是由Velculescu等在1997年提出的，是指某一特定生物体在特定状态下所有基因转录产物的总和，主要包括mRNA、非编码RNA[9]。相对于基因组而言，转录组更具有时间性、空间性，转录组反映的是特定条件下活跃表达的基因[10]，基因芯片技术是转录组学分析的常用方法。它起源于20世纪90年代，是指高密度固定在硅片、玻片、陶瓷等固相支持介质上的生物分子微阵列，具有快速、高效、微型化、高通量、大规模、高度并行性等特点[11]。因此，本研究通过基因芯片技术分析AT14A对拟南芥基因表达的影响，从而探讨AT14A的功能，以期为类整合素的研究提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　本试验所用的植物材料是拟南芥（Arabidopsis thaliana）。at14a基因位于3号染色体上，编号为AT3G28300。以野生型（Col）、纯合突变体（at14a）（SALK_101761）2种基因型拟南芥为材料。野生型拟南芥（Col）由加拿大大不列颠哥伦比亚大学陈金桂博士提供，后经笔者所在实验室自行繁种保存。at14a是AT14A的T-DNA插入功能缺失突变体。以不同组织的拟南芥为材料，提取总RNA，用于at14a基因的表达分析。以生长6周的拟南芥叶片为材料，提取总RNA，用于基因芯片分析。 　　1.2 试剂