抗CXCR4单克隆抗体对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子表达影响.docVIP

抗CXCR4单克隆抗体对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子表达影响 　　摘要：目的：探讨抗CXCR4单克隆抗体对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子表达的影响。方法：选取64只健康雄性SD大鼠，用链脲佐菌素（STZ）制造糖尿病大鼠模型。治疗组用抗CXCR4单克隆抗体玻璃体注射，对照组和未治疗组只给予等量生理盐水。注射1周后，摘取眼球，做视网膜HE染色切片观察各组大鼠视网膜结构，ELISA定量检测各组视网膜VEGF含量。结果：视网膜HE染色示CON组视网膜未见明显异常，DM未治疗组视网膜各层结构排列紊乱，视网膜内皮组织水肿，可见大量新生血管及突破基底膜的血管芽细胞核，DM治疗组视网膜内皮组织水肿减轻、新生血管减少。ELISA结果显示DM未治疗组VEGF含量（194.91±2.18）pg/ml，显著高于正常组VEGF含量（122.43±1.62）pg/ml，DM治疗组VEGF含量（143.65±1.46）pg/ml，3组比较均有统计学意义（P0.05）。结论：抗CXCR4单克隆抗体能够抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达。 　　关键词：糖尿病视网膜病变；抗CXCR4单克隆抗体；血管内皮生长因子；大鼠 　　中图分类号：R587.1 　　文献标志码：A 　　文章编号：1008-2409（2015）020011-04 　　糖尿病视网膜病变（DR）是最常见的视网膜血管病，其严重性主要以新生血管的形成为标志，而新生血管的形成与血管内皮生长凶子（VEGF）的失衡有密切的联系。日前研究表明，基质细胞衍生因子（SDF-1）及其特异性趋化因子4（CXCR4）在新生血管形成方面起重要作用引，且SDF-l/CXCR4轴与VEGF之间有积极的协同促进新生血管生长的作用。笔者通过玻璃体腔注射抗CXCR4单克隆抗体，研究其对糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　SD雄性大鼠，体重（200±20）g，由桂林医学院动物实验中心提供；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）；血糖仪及试纸（罗氏）；抗CXCR4单克隆抗体（12G5：sc-12764）（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；大鼠血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（博士德生物）。微量进样器（安亭）；研究级倒置荧光显微镜、正置相差显微镜（日本OIympus）；光栅型连续波长酶标仪、滤光片型多功能酶标仪（瑞士TECAN）；超低温冰箱（美国ThermoFisher）等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 糖尿病大鼠模型制作 选取64只雄性SD大鼠，周龄为7～8周，体重（200±20）g，适应性喂养2周，随机分为正常对照组12只（CON组），52只为糖尿病模型组；糖尿病模型组禁食不禁水12h后，按40mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素造模，在30min内注射完毕，注射后2只1笼饲养，之后恢复正常饮食，并给予1%的葡萄糖水饮用，间隔ld后，再次禁食不禁水12h，第2次相同剂量给药，重复3次，每周定期检测尿糖和血糖；1个月后，尿糖持续（卅）以上，血糖高于16.7mmol/L为成模标准。正常对照组同期腹腔注射等量柠檬酸缓冲液，给予正常饮食；糖尿病模型组造模成功共50只，再次随机分为抗CXCR4单克隆抗体治疗组（DM治疗组）和未治疗组（DM对照组）。 　　1.2.2 玻璃体体腔注药 注药前予氯霉素滴眼液滴大鼠双眼6次/d，共2d，注药前30min予复方托吡卡胺滴眼液滴双眼1次散大瞳孔，按300mg/kg剂量给予大鼠腹腔注射lO%水合氯醛进行麻醉，常规消毒，铺无菌洞巾，氯霉素滴眼液冲洗结膜囊。用消毒的10μl微量进样器从大鼠眼球角巩膜缘后约1mm处与眼轴呈45度朝视乳头方向刺人玻璃体腔，进针约1.5mm，缓慢注入药物。给药后停留15s退针，用棉签按压lOs防止药物反流。DM治疗组玻璃体腔注射200μg/ml抗CXCR4单克隆抗体，DM对照组及正常对照组玻璃体腔注射等量生理盐水。 　　1.2.3 制作病理切片 注药后1周，麻醉大鼠致死，取出眼球，用1ml注射器针头刺破眼球，先放人视网膜同定液中1min，然后取出放入lO%甲醛中浸泡24h以上。固定后进行脱水，二甲苯透明3～4min，60℃石蜡浸蜡2h，矢状位包埋眼球，做与视神经矢状轴平行的视网膜连续切片，切片间距5μm。在显微镜下观察视网膜结构及拍照。 　　1.2.4ELISA检测视网膜VEGF含量 麻醉后取眼球置于lO%甲醛中浸泡4h，然后取出眼球置于冰板上，沿角膜缘后0.5mm处环形剪开巩膜，除去眼前节和成形玻璃体，并吸取残余玻璃体液，分离视网膜神经上皮层获得视网膜组织，置于天平上称取重量，按1：9加人预冷的PBS，在冰水浴中用玻璃组织匀浆器处理视网