肉食品中β2―受体激动剂残留的常用筛选和确证方法.docVIP

肉食品中β2―受体激动剂残留的常用筛选和确证方法 　　【摘 要】本文首先介绍了β2-受体激动剂的药理作用和对食品安全的影响，然后介绍了以酶联免疫吸附法为代表的常用筛选方法，和以气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用为代表的确证方法，最后对肉食品中β2-受体激动剂的检测进行了展望。 　　【关键词】β2-受体激动剂；酶联免疫吸附法；气相色谱-质谱联用；液相色谱-质谱联用 　　1.引言 　　β2 -受体激动剂是一类能选择性与β肾上腺素受体结合，产生受体激动样作用药物的总称，是一系列以苯乙醇胺为母核，芳环和末端氨基多取代的衍生物（图1），药理作用主要为松弛支气管平滑肌、提高骨骼肌收缩力、增加肺通气量、增强支气管纤毛运动[1]，常用来治疗哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病。近年研究发现，β2-受体激动剂能通过肾上腺受体刺激腺苷酸环化酶的合成，从而升高环磷酸腺苷（cAMP）的浓度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它还可降低血液中镁离子浓度，间接促进肌肉兴奋，抑制蛋白质分解和脂肪合成，进而增加肌肉蛋白合成[2]。在禽畜饲养中添加β2-受体激动剂能够使动物生长速度加快，瘦肉相对增加。一般来说，饲料中添加适量，可使饲料转化率、生长速率和酮体瘦肉率提高超过10%，所以也称它为瘦肉精。然而，β2-受体激动剂的化学性质极稳定，日常烹饪过程如煮沸、烧烤和微波加热均不能使其分解。长期食用高剂量β2-受体激动剂残留的肉食品，会引起血压升高，血液中钾离子浓度降低，提高内脏平滑肌和横纹肌兴奋性，造成头疼、肌肉酸痛、上吐下泻等症状，对食用者的健康埋下隐患。鉴于其对食品安全的严重威胁，目前多数国家已经禁止在畜牧养殖中使用β2-受体激动剂作为兽药饲料添加剂。我国农业部也多次发布公告禁止将克仑特罗、沙丁胺醇等β2-受体激动剂及盐、酯等结合物用于所有食用动物中[3，4]。然而β2-受体激动剂的非法使用现象仍然严重。如2007年9月，上海市336人因食用了残留有克仑特罗的猪肉发生集体中毒事件。北京奥运会前夕，当时中国男子游泳队里最优秀也是最有望夺得奖牌的选手欧阳鲲鹏就是因为回家休假时与朋友吃了含有瘦肉精的烤串导致尿检呈阳性，进而被终身禁赛。 　　2.β2-受体激动剂残留的常用筛选方法 　　β2-受体激动剂的衍生物较多（表1），而且通常残留量较低，因此对其检测的方法提出了较高的挑战。最初，很多国家采用放射免疫分析法和酶联免疫分析法作为β2-受体激动剂的控制方法[5，6]，很快，免疫分析法因其高选择性和快速性得到了越来越多的应用，其中酶联免疫吸附法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）成为实验室应用最广泛的筛选方法。该方法利用抗原与抗体间的特异性反应，将待测物与中间酶连接，酶再催化底物产生有颜色的产物，通过酶标仪在特定波长下检测产物的?色来判断待测物的含量。操作中一般用稀酸溶液提取，离心，调pH，用样品稀释液稀释并在450nm波长处测定吸光值。检测时注意提取液的pH，一般要求在6.5～7.5，在所有恒温孵育过程中避免光线照射。目前，用酶联免疫吸附法检测肉制品中的β2-受体激动剂主要有克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。我国农业部在2008年的1025号公告中首次发布了动物性食品中多种β-受体激动剂残留检测的酶联免疫吸附法国家标准[7]。 　　目前常用的酶联免疫吸附法试剂盒品牌有“北京望尔”“美国柏尔”和“英国朗道”等，灵敏度可达ng/g（μg/kg）水平，可以满足筛选分析的要求。陈穗等[8]使用克仑特罗试剂盒（德国r-Biopharm公司），从方法的检出限、校正曲线的线性范围、精密度、加标回收率测定等方面对酶联免疫法检测猪尿中克仑特罗残留量的质量控制方法进行了探讨。结果表明.该试剂盒的样品检测下限为0.03 μg/kg，定量下限为0.1 μg/kg。当克仑特罗标准添加水平为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg时，平均回收率分别约为84%和90%，均符合残留分析质量控制要求。 　　经方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。然而，由于不同生产厂家研发的试剂盒存在抗体提取及反应活性不稳定等因素，不同品牌甚至同一品牌不同批次之间都存在差异，因此免疫分析法始终不能成为法定的确证方法。 　　3.β2-受体激动剂残留的常用确证方法 　　3.1 气相色谱-质谱联用 　　官方检验机构无论是筛查还是确证都倾向于选择灵敏度高、特异性强、重复性好的质谱方法。20世纪80年代以前，气相色谱-质谱联用（GC-MS）是日常检验唯一的选择。该方法具有较高灵敏度和较强专属性，同时由于β2-受体激动剂的化学结构中有不易气化的羟基和氨基，因此需要对处理后的样品进行衍生化。常用的衍生化试剂有N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MST