效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物醛糖还原酶抑制活性研究.docVIP

效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物醛糖还原酶抑制活性研究 　　[摘要] 目的：用效应面法对蒙花苷的水解工艺进行优化，通过醛糖还原酶模型研究其水解物金合欢素醛糖还原酶的抑制活性。方法：建立水解物金合欢素体外生物酶模型，通过测定NADPH的荧光吸收，计算水解物金合欢素对醛糖还原酶的抑制率，从而得到水解物的醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值。在蒙花苷水解工艺中采用效应面法优化水解工艺，并对结果进行预测分析。结果：水解物金合欢素醛糖还原酶抑制活性，其IC50的平均值为2.74 mg?L-1。优选的水解工艺为水解时间7.4 h，硫酸甲醇0.54 mol?L-1，固液比3∶1。结论：水解物金合欢素具有比蒙花苷较好的醛糖还原酶抑制活性。优选的蒙花苷水解工艺简便，预测性良好。 　　[关键词] 蒙花苷；效应面分析法；金合欢素；醛糖还原酶抑制剂 　　[收稿日期] 2013-12-09 　　[通信作者] 张铁军，Tel：（022E-mail：tiezhang4@ 　　[作者简介] 王娇，硕士研究生，Tel：（022E-mail：taoqibaojiaojiao369@ 　　糖尿病慢性并发症是严重影响患者生命质量的全身性病变，糖尿病视网膜病变是发病率较高的一种糖尿病慢性并发症。醛糖还原酶抑制剂是通过抑制醛糖还原酶的活性，间接抑制多元醇通路的一类延缓和阻断糖尿病并发症的药物[1-2]。近年来从植物提取出的具有抑制醛糖还原酶活性的化合物主要有黄酮类化合物。 　　蒙花苷为菊科植物野菊花Chrysanthemum indicum L.的主要天然黄酮类成分[3]。近年来国内外研究表明，蒙花苷对大鼠晶状体的醛糖还原酶（AR）有抑制活性[4]。本实验室前期研究表明，蒙花苷属于低溶解度，透过性较差的药物[5]。药物比表面积和脂溶性对药物体内吸收有重要的促进作用，因此通过去糖基化增加蒙花苷的比表面积和脂溶性，对蒙花苷进行结构修饰。效应面法具有试验次数少，精确度高，应用方便的特点，该设计方法可以很好地应用于药学领域[6]。本研究以蒙花苷水解率为指标，运用效应面法进行蒙花苷水解工艺优化。选用经典的非细胞模型[7-9]，评价醛糖还原酶在水解物金合欢素干预下的变化。 　　1 材料 　　Lab Alliance高效液相色谱仪（SeriesⅡ一元泵系统，Lab Alliance色谱工作站）；AB204-N电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；HS-3120超声波清洗器（奥特赛恩斯机器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）。 　　蒙花苷对照品（实验室自制，经HPLC归一法检测纯度97%），金合欢素（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析醇。 　　Wister大鼠，雄性，天津市山川红实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（津）2009-0001。 　　2 方法与结果 　　2.1 含量测定 　　2.1.1 色谱条件 流动相乙腈-水-冰醋酸（40∶59∶1）；体积流量1 mL?min-1；检测波长326 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。 　　2.1.2 标准曲线的绘制 分别精密称取蒙花苷和金合欢素对照品5.35，11.00 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作为蒙花苷对照品储备液和金合欢素对照品储备液。采用逐级稀释法用甲醇配置成不同浓度的蒙花苷对照品溶液和金合欢素对照品溶液，摇匀，按照2.1.1项下色谱条件进行测定，记录蒙花苷色谱峰面积及金合欢素色谱峰面积。以蒙花苷对照品溶液质量浓度为横坐标（XL），峰面积积分值为纵坐标（YL）进行线性回归，得回归方程为YL=7XL-373.742，R2=0.999 2，线性范围0.1～52.9 mg?L-1；以金合欢素对照品溶液质量浓度为横坐标（XA），峰面积积分值为纵坐标（YA）进行线性回归，得回归方程为YA=7XA-4 828.128，R2=0.999 0，线性范围2.2～110.0 mg?L-1。 　　2.1.3 水解率的计算 蒙花苷水解率=金合欢素峰面积/（金合欢素峰面积+蒙花苷峰面积）×100%。 　　2.2 单因素试验设计 　　2.2.1 水解时间 称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，加入相应0.45 mol?L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间分别设为4，5，6，7，8，9 h，放冷，取上清液测定蒙花苷水解率，结果见图1，可知最适水解时间为7 h。 　　2.2.2 酸浓度 称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，分别加入0.15，0.3，0.45，0.6，0.75 mol?L-1硫酸甲醇，搅拌