新生大鼠皮层神经元原代培养及糖氧剥夺损伤模型建立.docVIP

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖氧剥夺损伤模型建立 　　摘要：目的建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。方法取新生的大鼠（24 h）大脑皮层组织，消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液种植，4~8 h后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化，用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组，Western blotting检测NSE蛋白表达。结果2~8 h神经元细胞贴壁，随着时间的延长，形态呈多变，突起逐渐增多，神经元突起间相互接触形成网络，培养7~10 d时神经元胞体最为丰满，通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低。结论该神经元方法简单易行，神经元纯度较高，并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。 　　关键词：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型 　　 神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心； Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。无血清培养基： Neurobasal培养基+2%B27培养基添加剂(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 双抗(100U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，于冰箱4℃保存备用；多聚-L-氨酸包被液：用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。 　　1.2方法 　　1.2.1大鼠皮层神经元的分离和培养 取24 h内新生的SD大鼠，采用颈椎脱臼处死小鼠后，放入盛有75%酒精的烧杯中消毒1～2 min。在无菌的环境下用剪刀迅速断头，用预冷的PBS液中漂洗干净移入另一个装有预冷H-DEME的容器内，充分暴露大脑皮层，在显微镜下剥尽皮层的脑膜及血管，将皮层组织剪成碎组织块，向剪碎的组织中加入浓度为0.05%的胰酶在37°C下进行消化，15 min后 终止消化作用。使用1 mL进口枪头对组织进行反复吹打（10次），注意动作要轻柔，且不可产生气泡。 将吹打后的细胞悬液转移入15ml的离心管中于4°C离心 1000 rpm，5 min，使用配制好的培养液对细胞进行重悬。200目筛网过滤，以1×106个细胞/mL，接种于经多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培养液2 mL，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。 　　1.2.2大鼠皮层神经元鉴定 免疫细胞化学方法验证神经元细胞的特异性和纯度皮层神经元培养到第7 d时，胞体发育饱满，取出爬片，选择NSE作为皮层神经元特异性标志物，按标准的免疫细胞化学染色法进行鉴定，按说明书步骤进行，以PBS缓冲液代替I抗作阴性对照。随机去3个视野计数阳性细胞百分数并照片。 　　1.2.3糖-氧剥夺损伤模型的建立 选取培养7 d的神经细胞，吸去培养基并用PBS液轻轻冲洗2遍，用95%氮气和5%二氧化碳气体饱和10 min后的无糖培养基造成缺糖环境，在充满氮气的37℃的细胞培养箱孵育45 min，然后换回原培养液，在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育6 h。 　　1.2.4 Western blotting检测神经元细胞的NSE蛋白表达水平 分别提取对照组和糖-氧剥夺组神经元蛋白提取，煮沸变性，电泳2 h，封-闭1~2 h，加一抗NSE (1∶500)、4℃过夜，加HRP标记抗兔二抗孵育1~2 h（1∶30000），曝光rad凝胶