昆虫杆状病毒表达载体系统研究及应用.docVIP

昆虫杆状病毒表达载体系统研究及应用 　　摘 要 昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品，该系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。文章介绍了该系统的产生．发展和技术原理，同时概述了该系统在基础研究、医药和农林业等领域的应用情况。 　　关键词 昆虫杆状病毒表达载体系统，基础研究，医药，农林业 　　杆状病毒(baculovirus)是节肢动物的专性病原物，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫。根据国际病毒分类委员会(1CTV)最近出版的第7次病毒分类报告，杆状病毒科只包括2个属：核多角体病毒属(NucleopolYAedrovirus)和颗粒体病毒属(Granulovirus)。早在16世纪昆虫病毒就已发现，但直到20世纪50年代，随着电子显微镜的发明，昆虫病毒学研究才得以飞速发展。近年来，昆虫病毒学研究已引起人们高度重视，其主要原因为：(1)昆虫杆状病毒可作为真核表达载体系统表达外源基因，用于基础生物学研究及医疗卫生检疫等；(2)作为杀虫剂，可有效地控制农林害虫的发生，并对环境不造成污染。因此，在国内外杆状病毒学者卓有成效的研究下，昆虫杆状病毒表达载体系统的研究与应用取得了很大进展。 　　 　　1 昆虫杆状病毒表达载体系统简介 　　 　　昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，其基因组在90～230 kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。由于昆虫杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，且其较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA的插入，这为昆虫杆状病毒的重组提供了广阔发展空间。 　　杆状病毒表达载体系统(baculoviNsexpressionvector system，BEVS)是一个以昆虫杆状病毒(主要是NPV)为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比，它具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。昆虫杆状病毒载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。 　　自Smith 1983年首次利用苜蓿银纹夜蛾核多角 体 病 毒(Autographacalirkrnicanucleopolyhedrovirus，AcNPV)在草地贪夜蛾Laphygmafrug真Ferda细胞Sf9中成功表达出人p―干扰素，以及1985年，Maeda用家蚕Bo-m61zmD／g NPV作表达载体，在家蚕体内高水平地表达出人α－干扰素以来，作为当今基因工程四大表达系统之一的杆状病毒表达载体系统因其独特的优点和巨大发展潜力，日益受到各国学者重视。据统计，用杆状病毒表达载体系统表达的外源基因已近千种，如第一个被美国食品与药物管理局(FDA)批准进行人体实验，拟用于预防艾滋病的基因工程疫苗，就是用BEVS表达生产的。目前，用于外源基因表达的昆虫杆状病毒仅限于核多角体病毒属，其中研究利用最多的载体有AcNPV、BmNPV、粉纹夜蛾核多角体病毒(了richoplusia ni，TnNPV)和柞蚕核多角体病毒(Antheraea pemyi，ApNPV)。而AcNPV和草地贪夜蛾细胞系统是国际上普遍采用的杆状病毒表达载体系统研究模型。 　　 　　2 昆虫杆状病毒表达载体系统原理及构建方法 　　 　　昆虫杆状病毒表达载体是一种辅助性依赖(仅有质粒载体不能表达外源基因，还需野生型杆状病毒辅助，形成整合有外源基因的重组型杆状病毒才能完成外源基因的表达)的真核DNA表达载体。所用转录调节信号是单一或多个杆状病毒的启动子，分别有极早期、早期、晚期、极晚期等几种类型启动子，其中最常用的是极晚期启动子－多角体蛋白启动子(polyhedrin(PH)启动子)和P10。有3种最常见的寄主细胞系用于BEVS中：Sf9，sr21，TN581―4(High-5细胞)；有2种最常见的寄主昆虫用于BEVS中：家蚕和柞蚕。 　　构建重组昆虫杆状病毒，其关键在于构建转移载体质粒。经过10余年的努力，人们已经构建了大量用于不同目的与不同需要的转移载体质粒。其基本要点是在基础质粒(如pUC质粒)上插人多角体蛋白基因及其两端侧翼，并在多角体蛋白基因启动子之下的编码区产生缺失，去除编码序列，然后在此缺失部位插人多接头，用于外源基因的克隆。用此载体与亲本病毒共转染昆虫细胞，利用载体中多角体蛋白基因的两端侧翼与亲本病毒DNA之间的同源性进行重组，从而获得含外源基因的重组病毒。从理论上讲有2种重