核磁共振波谱对大米脱水素K片段在模拟膜中结构研究.docVIP

核磁共振波谱对大米脱水素K片段在模拟膜中结构研究 　　摘 要 脱水素是一类植物抗逆相关蛋白，可帮助植物抵抗干旱、低温、盐碱等环境胁迫。富含赖氨酸的K片段是脱水素中的保守功能片段，在低温保护和膜保护功能中起至关重要的作用。目前，脱水素及K片段的作用机理仍不完全清楚。本研究采用圆二色谱（CD）和核磁共振波谱（NMR）方法及分子动力学模拟计算研究了具有抗菌活性的大米脱水素K片段在模拟膜中的三维结构及其与膜的结合方式。圆二色谱研究表明，水中呈现无规卷曲构象的K片段在模拟膜中会形成α-螺旋结构。核磁共振结构研究进一步证实了K片段在模拟膜中的空间结构，即中间部分形成了两亲性的α-螺旋结构，其中，疏水残基位于螺旋结构的一面，亲水残基位于螺旋结构的另一面。扩散排序（DOSY）核磁共振实验表明，K片段与膜在水溶液中形成了稳定的结合体； 顺磁性探针检测表明，整个K片段插入膜中，其中疏水面朝向模拟膜的疏水核，其它部分朝向模拟膜亲水表层。本研究得到的K片段在模拟膜中的精细结构为理解环境胁迫下K片段及脱水素与膜的作用机理提供了重要信息。 　　关键词 脱水素；核磁共振；三维结构；膜结合；分子动力学模拟；K片段 　　1 引 言 　　脱水素，又称二族胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA蛋白），是一类与植物抗逆反应相关的重要蛋白质。这类蛋白质在植物胚胎发育晚期表达量十分丰富，在环境胁迫（如干旱、低温、盐碱等条件）下也会大量累积[1，2]。因此，脱水素被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的重要物质之一，是当前抗逆研究方面备受关注的一类蛋白?|。脱水素的显著特点是拥有一个或多个富含赖氨酸的保守性K片段。截掉K片段，会使得脱水素ERD10、RcDhn5和TaDHN-5对脱氧脱氢酶（LDH）的低温保护活性降低[3，4]。K片段自身也可以对LDH起到低温保护作用[5]。 近期研究表明， 脱水素还具有抗菌活性，K片段在其中起关键作用，且K片段自身具有类似全长蛋白的抵抗革兰氏阳性菌活性[6]。在遭受各种胁迫的情况下，小麦脱水素的K片段通过阻止蛋白聚集对大肠杆菌起到保护作用，而且K片段也具有抗革兰氏阴性、阳性菌和真菌的活性[7，8]。河岸葡萄的K片段可以在受到冻融损害时阻止膜融合，并在不改变膜的流动性和表面可及性情况下降低膜转变温度，对膜起到重要的保护作用[9]。 上述研究结果表明， 在脱水素的低温保护及抗菌功能中，K片段发挥着至关重要的作用。尽管体内及体外实验证明了脱水素及K片段的重要性，但目前对其分子作用机制仍不完全清楚。功能是蛋白质结构的生化表现特征，结构是蛋白质行驶功能的基础。因此，研究脱水素及其重要功能区域的结构特征是全面认识其作用机制的有效途径。 　　脱水素具有高度灵活的结构，它包含大量亲水残基，被认为是天然无规蛋白。然而，当环境发生改变（如缺水或是与膜表面结合）时，脱水素可以形成一些有序结构[10]。K片段被预测可以形成两亲性的螺旋结构，因此推测其与脱水素的结构改变密切相关[10]。详细探究K片段的精细结构对于揭示K片段，甚至于整个脱水素的作用机理是非常必要的。核磁共振波谱（NMR）技术是原位研究溶液中蛋白质三维结构的主要分析方法，它不仅可在原子水平上提供蛋白质在生理条件下的空间结构[11～13]，还可通过观察蛋白质上个别基团的行为特点为分析其分子相互作用等研究提供重要信息。本研究以具有抗菌活性的大米脱水素K片段[6]作为研究对象，利用圆二色谱（CD）、NMR等多种谱学方法及分子动力学模拟计算等手段研究了K片段在模拟膜SDS胶束中的三维结构及其与模拟膜的相互作用方式， 为进一步了解K片段乃至脱水素抗菌及膜保护机理提供了精细的三维结构及取向信息。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　J-810圆二色谱仪（日本Jasco公司）； AVANCE核磁共振波谱仪（600 MHz，Bruker 公司）。合成肽K片段（KKGFLDKIKEKLPGGHKK，纯度95%，苏州强耀生物科技有限公司）。重水（D2O， 99.8%）、氘代十二烷基磺酸钠（SDS-d25， 98%），均购于Cambridge Isotope Laboratories公司。实验用水为去离子水。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 远紫外圆二色谱（Far-UV CD） 样品制备：（1）水溶液中样品制备：将适量K片段直接溶于水中，肽的浓度为30 μmol/L。（2）SDS中样品制备：分别将适量K片段和SDS溶于水中，将肽溶液移入SDS溶液，旋转混匀，制得K片段浓度30 μmol/L、SDS浓度10 mmol/L的水溶液样品。 　　圆二色谱检测所用石英比色皿的光程为0.1 cm，波长扫描范围190～260 nm； 带宽1.0 nm； 实验检测温度为25℃。每个样品扫描3次，每张CD谱图