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水产品中孔雀石绿残留检测方法优化 　　摘要：通过优化提取方式、提取溶液、浓缩条件、检测条件等，建立高效液相色谱荧光法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的方法。样品经硼氢化钾溶液、乙腈提取，二氯甲烷萃取，用45 ℃氮气吹干，丙基磺酸阳离子（PRS）固相萃取柱净化，采用Agilent XDB C18色谱柱（1.8 μm），以乙腈-乙酸铵缓冲液（0.125 mol/L，pH值4.5，体积比80 ∶ 20）为流动相，用超高效液相色谱荧光检测器进行检测。方法的检测限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg，4个加标水平（1.0、2.5、5.0、10.0 μg/kg）的回收率为86.4%～95.3%（n=6），相对标准偏差为2.8%～5.6%。该方法简便快捷、准确度高，易于推广应用，能满足水产品中孔雀石绿及其代谢物残留的检测要求。 　　关键词：高效液相色谱法；水产品；孔雀石绿；残留检测；优化 　　中图分类号： TS207.3；O652.63 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0333-03 　　孔雀石绿（malachite green，MG）是一种三苯甲烷类染料，它在生物体内快速代谢为无色孔雀石绿（leuco-malachite green，LMG），具有致癌、致畸、致突变等毒性[1-2]，因此美国、欧盟等禁止将孔雀石绿用于食品用水产动物的养殖，我国也在2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。但是，由于孔雀石绿对鱼类水霉病等疾病具有特效，且价格低廉，目前在鱼苗繁育、长途运输等过程中非法使用的问题屡有发生[3]。 　　目前，水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的检测方法主要有高效液相色谱法、液质联用法、酶联免疫法等[4-7]。目前农业部开展全国水产品产地监督抽检、城市例行监测等任务时，以GB/T 20361―2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》[8]作为水产品中孔雀石绿的定量检测方法，但该方法前处理过程繁琐、操作步骤多。本试验通过对GB/T 20361―2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》前处理过程进行优化与改进，主要包括提取方式、提取溶液、浓缩条件等因素，以期建立1种前处理简单快捷、结果准确度高并且稳定的孔雀石绿及其代谢物残留的测定方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　Agilent 1200超高效液相色谱仪，配荧光检测器； TurboVap LV浓缩工作站。 　　孔雀石绿、无色孔雀石绿，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度99%；乙腈、二氯甲烷，色谱纯，购自美国TEDIA公司；其余试剂均为分析纯。丙基磺酸阳离子固相萃取柱（PRS，500 mg/3 mL），购自美国Agilent公司。 　　提取液：称取0.54 g硼氢化钾，加入25 mL水溶解，再加入75 mL乙腈混匀。 　　洗脱液：称取1.54 g无水乙酸铵，溶解于200 mL水中，用浓氨水（25%～28%）将pH值调至10.0，再与乙腈按体积比1 ∶ 1进行混合。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 样品前处理 称取5.00 g样品，加入15 mL提取液，涡旋2 min，4 000 r/min离心10 min，将上清液转移至125 mL分液漏斗中；在离心管中加入10 mL乙腈，涡旋2 min，8 000 r/min 离心10 min，合并上清液于分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷，剧烈振摇2 min，静置分层1 h，将下层溶液转移至50 mL浓缩管中。用45 ℃氮气吹至0.5～1.0 mL，加入5 mL乙腈溶解残渣。PRS柱用5 mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再分别用3 mL乙腈润洗浓缩管2次，依次过柱。最后将PRS柱吹至近干，加入3 mL洗脱液，收集洗脱液并定容至3 mL，供液相色谱测定。 　　1.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent XDB-C18柱，4.6 mm×50 mm（内径），粒度1.8 μm；柱温为35 ℃，进样体积为5 μL；流动相为乙腈-乙酸铵缓冲液（0.125 mol/L，pH值4.5，体积比80 ∶ 20），流速为0.15 mL/min；检测器为荧光检测器，激发波长为265 nm，发射波长为360 nm。 　　2 结果与分析 　　2.1 样品提取方式优化 　　GB/T 20361―2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》的基本原理是通过乙酸铵乙腈溶液提取，用硼氢化钾将提取液中的孔雀石绿还原成无色孔雀石绿，采用荧光检测器进行检测。本方法中需要加入盐酸羟胺溶液、乙酸铵缓冲液、乙腈等多种试剂，同时需要对样品进行4次提取，提取过程