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梨果实酸低酸性状SSR分析 　　摘要：以八月红(pyruu communis L‘Bayuehong’)×砀山酥梨(P×bretshneider‘Dangshansuli’)F1代杂交分离群体(共118株)为试材。测定了成熟果实的酸含量，从表型上分析了梨果实含酸量的遗传规律。利用225对源自梨和苹果基因组的SSR引物。结合分离群体分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)和选样基因型分析(Selective genotyping，sG)法，对酸／低酸性状进行群体分离分析，结果表明，标记KUl0与聚实酸，低酸性状连锁，遗传距离为12.15cM，并由此将果实酸，低酸性状的QTL初步定位到梨遗传图谱的第2连锁群上。表型分析和标记分析结果表明，梨果实酸性状对低酸性状为娃性，受加性效应和环境因素的影响，同时存在一定的非加性效应。 　　关键词：梨；酸，低酸性状；SSR；BSA；选择基因型分析 　　中图分类号：S661.2　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)03-389―05 　　 　　有机酸含量是影响果实品质的重要因素之一。糖、酸、单宁和芳香物质等是果实感官品质的重要组成，其中糖、酸的绝对含量及糖酸比起主要作用…。由于糖变化范围较小，而酸变化幅度较大，果实糖酸比实际上主要是由酸决定的。目前对梨果实酸性状遗传的研究主要是通过果实含酸量的表型值来进行其遗传规律分析的。高海燕等对不同品种梨汁中的有机酸含量进行测定和分析，认为梨汁中以苹果酸和柠檬酸为主，苹果酸含量最高，各种有机酸均表现为连续变异，与其他种类的有机酸相比。苹果酸的变化更能反应总酸的变化趋势。李俊才等研究认为梨含酸量为多基因控制的数量性状遗传，其分布较广，遗传传递力较低，既受加性效应的影响，也存在一定的非加性效应。苹果、桃、柑橘类和番茄果实的有机酸含量也是由一对主效基因和其他多基因控制，既有基因的加性效应，也存在不同程度的非加性效应。尽管番茄果实的苹果酸和柠檬酸均由多基因控制。但其低酸性状分别由一个主效基因控制，并且这2个主效基因相连锁。在苹果和柑橘类果实上，主效基因的纯合个体多表现为极酸或极甜，低酸性状表现为隐性，杂合则表现为中酸类型。与梨果实酸含量性状相关的分子标记尚未见报道。我们针对数量性状的遗传特性，利用SSR标记技术并结合BSA和选择基因型分析的方法，拟筛选获得与酸性状连锁的SSR标记，为进一步开展梨果实酸／低酸性状分子辅助育种奠定基础。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　材料为八月红(含酸量0.2％)×砀山酥梨(含酸量0.074％)的F1代杂交分离群体，共118株，其中成熟果实含酸量最高为0.77％，最低为0.06％。植物材料定植于中国农业科学院郑州果树研究所。 　　 　　1.2　梨果含酸量的测定 　　梨果实的含酸量以可滴定酸表示，采用碱滴定法测定。 　　 　　1.3　基因组DNA的提取 　　取幼嫩的叶片，采用改良CTAB法㈣提取基因组DNA，经RNase A消化处理。获得的DNA经紫外分光光度计测定纯度和含量，用无菌ddH20将浓度调至50mg?L-1，-20℃保存。 　　 　　1.4　酸，低酸近等基因池及选择基因型子群体的构建 　　根据BSA法取杂交后代果实表现为极酸和极低酸的个体各8株，分别将其基因组DNA等量混合，组成非酸性状基因池和酸性状基因池；根据选择基因型分析法(Selective genotyping，SG)的原理，选取F1代分离群体中高、低含酸量的极端类型材料各25个构成选择基因型子群体。 　　 　　1.5　SSR分析 　　SSR引物来自文献，多数引物在种间和种内都具有较好的通用性，其中90％以上的引物已被定位在梨和苹果的遗传连锁图谱上。并且覆盖17个连锁群，引物由上海Invitrogen公司合成，其序列汇总于参考文献。PCR反应体系为20μL：50mg?L-1DNA模板1.0μL，10xPCR Buffer 2.0μL，25mmol?L-1MgCl21.2μL，10mmol?L-1dNTP 0.4μL，10μmol?L-1正反向引物1.0μL，Taq酶(5U?μL-1)0.15μL，加ddH2O至反应总体积20μL。混匀后在BIO-RAD My Cycler Thermal Cycler梯度PCR仪上进行扩增，PCR扩增程序为：94℃2min30s，94℃45s，60℃1min(每次循环降低1℃)，72℃1min，7次循环，94℃45s，60℃1min，72℃1min，35次循环，72℃10min，4℃10min(保存)。用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染显色。Taq酶和dNTP购自大连TaKaRa公司。 　　 　　1