柠檬酸催化大豆异黄酮糖苷水解苷元工艺研究.docVIP

柠檬酸催化大豆异黄酮糖苷水解苷元工艺研究 　　摘要：以水解前后大豆异黄酮糖苷含量变化计算水解率为评价指标，采用单因素和正交试验法对水解的工艺条件进行优化。结果表明，柠檬酸催化大豆异黄酮糖苷水解苷元最佳工艺为：反应温度127℃，反应时间为1.8h，柠檬酸水溶液浓度为1.6mol/L，水解率达到90%以上。 　　关键词：大豆异黄酮糖苷；大豆异黄酮苷元；水解；柠檬酸；正交试验 　　中图分类号：O629.13文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0294-03 　　大豆异黄酮的健康功效多种多样，可以预防多种疾病和改善骨健康状况[1]。大豆中天然存在的异黄酮包括大豆异黄酮糖苷和大豆异黄酮苷元2类，其中，大豆异黄酮糖苷占到了总异黄酮含量的80%～95%，糖苷型大豆异黄酮由于分子较大，食用后不能被人体直接吸收，一般是在体内消化酶作用下转化为苷元被人体吸收，因此大豆异黄酮的生物活性主要是苷元，而不是糖苷，但目前各种类型保健品大豆异黄酮主要成分是糖苷，资料显示，体内消化酶一般水解率在20%～40%，产品功效较低[2-3]。另外，每个人肠道消化酶不太一样，即使食用同样的大豆异黄酮，个体间效果相差很大。因此体外水解工艺开发就具有实际意义。 　　目前，大豆异黄酮糖苷转化苷元的方法最常用的是酸催化法、碱催化法、酶催化法[4-6]。酸水解法是大豆异黄酮糖苷水解中使用最多的一种方法。酸水解通常用盐酸、硫酸作催化剂，强酸条件下水解会影响大豆异黄酮苷元的稳定性。糖苷键具有缩醛结构，对碱较稳定，异黄酮糖苷键具有酯苷性质，可用碱水解为大豆异黄酮苷元和葡萄糖，碱催化产物苷元容易降解，应用受到很大限制。酶水解法具有水解条件温和，产物稳定性好，纯度高等特点，但酶生产成本很高，而且酶不容易重复利用。工业生产中还需要进一步寻找廉价又高效能够水解大豆异黄酮的β-葡萄糖苷酶，并进一步研究低成本酶固化技术。 　　柠檬酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。用柠檬酸做催化剂来催化大豆异黄酮糖苷的水解，避免目前工业上采用酸、碱等水解方法对设备的腐蚀，水解产物无需分离直接用于功能性食品，能够将无效或低效成分大豆异黄酮糖苷变为有效和高效成分大豆异黄酮苷元，增强了大豆异黄酮的生物活性，弥补了现有大豆异黄酮转化苷元工艺中选用盐酸催化、碱催化和酶催化等技术缺陷，因此是一条应用价值较高工艺路线。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　大豆异黄酮糖苷标样：大豆苷，黄豆黄苷、染料木苷（天津马克生物有限公司公司），含量超过98%。糖苷型大豆异黄酮提取物（西安金绿生物工程公司），含量为91.3%。甲醇为色谱纯，柠檬酸（AR），乙醚（AR）。 　　1.2主要仪器 　　高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；分析天平（北京医用天平厂）；CS101-3型电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂）；KQ-250VDE型双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 　　1.3试验步骤 　　称取大豆异黄酮糖苷50mg置于50mL圆底烧瓶中，加入一定浓度柠檬酸水溶液10mL，超声水浴1h，超声频率45kHz，水浴温度75℃。反应液转移到高压釜中，反应温度为110～130℃，反应时间为0.5～2h，反应结束后，冷却反应液至室温。取一定量反应液用饱和碳酸钠水溶液中和至pH值=7，用乙酸乙酯萃取，取酯层，在硅胶板上点样，放入展开剂（乙酸乙酯∶三氯甲烷∶甲醇=5∶5∶2）中展开，紫外灯下观察水解程度；另取一定量反应液用甲醇稀释到100mg/L，过0.45μm滤膜后上机，用HPLC定性和定量检测反应液中糖苷的含量。 　　1.4高效液相色谱法（HPLC）测定糖苷及其苷元的含量 　　1.4.1色谱条件 　　色谱柱：ShimadzuVP-ODSC18柱，150mm×4.6mm，5μm；流动相：A为0.4%磷酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～10min，30%～35%B；10～20min，35%～40%B；20～30min，40%～55%B；30～40min，55%～65%B；流速：1mL/min；检测波长为：260nm，测定温度为30℃；进样量：20μL。 　　根据糖苷和苷元化学性质的不同，从色谱柱中流出的先后顺序不同，经紫外检测器测定，通过与标准品比较，以保留时间定性，峰面积定量，外标法计算。 　　大豆异黄酮糖苷水解率=水解前后大豆异黄酮糖苷含量之差/水解前大豆异黄酮糖苷含量×100%。 　　1.4.2标准曲线的绘制 　　精确称取一定量大豆异黄酮糖苷标准品于100mL的容量瓶中，用甲醇超声溶解30min，再用甲醇定容至刻度线，摇匀，分别精确吸取上述标准溶液1、2、3、4