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根癌农杆菌介导食用菌转化研究 　　近年来，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的食用菌遗传转化研究取得了一定的进展。为此，笔者对农杆菌介导转化的原理、转化的食用菌种类以及影响转化效率的相关因素进行了系统阐述。并分析了农杆菌介导食用菌转化中存在的问题，以及对该技术在食用菌中的应用前景进行了展望。 　　食用菌； 根癌农杆菌； 遗传转化 　　食用菌又称蕈菌，通常指那些能够形成大型肉质子实体的真菌。约有95%的食用菌属于担子菌，少数属于子囊菌[1]。食用菌味道鲜美，营养丰富，同时许多还具有药用价值。而且像金针菇（Flammulina velutipes）、刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）等已经实现周年化、工厂化生产，产业发展前景广阔。因此，利用分子生物学手段和基因工程技术进行食用菌菌种改良、基因功能研究具有重要的现实意义。 　　遗传转化技术是进行食用菌分子育种和基因水平研究的重要手段之一。但食用菌基因工程研究起步较晚，没有一个稳定、高效的外源基因转化系统是制约利用分子生物学方法进行食用菌遗传改造的主要障碍。传统的遗传转化方法聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导法[2]、电击法[3]、基因枪法[4]、限制酶介导整合法[5]等由于操作复杂、转化效率低等原因，限制了这些方法在食用菌功能基因研究中的应用[6]。与此同时，根癌农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation， ATMT）由于转化受体形式多样、转化效率高以及TDNA单拷贝整合等特点，近些年在食用菌转化研究中得到了一定的应用[7]。另外，ATMT技术在众多丝状真菌中的成功运用也鼓舞人们在食用菌转化研究中对ATMT技术开展更多的探索研究。鉴于此，笔者就ATMT的原理和已应用的食用菌种类，以及影响转化的因素等方面进行了介绍，以期为相关研究提供有益指导。 　　1根癌农杆菌介导转化的原理和已应用的食用菌种类 　　根癌农杆菌是革兰阴性土壤杆菌，自然条件下可以侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤。在冠瘿瘤的形成过程中，根癌农杆菌留在受体细胞间隙中，其环状Ti（tumorinducing）质粒上的TDNA在细胞内被加工、剪切、复制后，转入受体细胞并随机插入到受体的基因组中[8]。农杆菌侵染的过程是农杆菌与受体细胞之间相互作用的结果。总体来说，TDNA从农杆菌到真菌细胞的转移过程中，农杆菌细胞内Vir蛋白因子起了主要作用，且真菌中TDNA转移的原理与植物中的具有相似性[9]。单链TDNA进入真菌细胞到整合到受体基因组的过程中，推测真菌细胞内各种蛋白因子可能起了重要作用，目前对这一过程相关分子机制研究的还不是很清楚。 　　自1995年BUNDOCK等[10]利用ATMT技术成功建立了酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ） 的转化系统以来，ATMT技术的应用范围逐步扩展到菌物界。1998年，DE GROOT等[11]利用改进的ATMT技术转化了泡盛曲霉（Aspergillus awamori）等几种丝状真菌，发现异源TDNA往往以单拷贝形式随即插入到丝状真菌染色体上，ATMT转化的这一优点为转化子在基因水平的研究提供了极大方便。近十几年来，ATMT技术在食用菌遗传转化方面已经取得了显著进展（表1），已报道至少有16种食用菌实现了农杆菌介导的转化。随着ATMT技术的不断完善和发展，这一重要的转基因技术在食用菌中的应用范围可能会进一步扩大，ATMT是未来食用菌分子遗传学研究的重要方法和工具，在食用菌定向分子育种、基因功能研究以及外源蛋白表达等方面具有重要的研究和应用价值。 　　2影响食用菌ATMT效率的因素 　　转化效率高低是衡量一个转化系统好坏的重要指标。综合近些年来食用菌ATMT研究的成果来看，农杆菌菌株的类型、双元载体上启动子以及食用菌组织的类型是影响农杆菌转化效率的关键因素。为了优化ATMT体系，提高其转化效率，并使其能够适用于更多、更难转化的食用菌种类，需要对影响食用菌ATMT转化效率的因素进行探究和优化。 　　2.1农杆菌菌株对转化效率的影响 　　目前，食用菌的转化中常用的农杆菌菌株有LBA4404、GV3101、AGL1、LBA1100、 EHA105等。这些农杆菌菌株由于染色体遗传背景和所含有的Ti质粒不同[24]，转化效率可能存在较大差异。CHEN 等[12]在进行双孢蘑菇的ATMT研究时，比较了农杆菌菌株AGL1、EHA105以及GV3850的转化效率，结果AGL1和EHA105菌株都获得了大约23% 的平均转化效率，但GV3850菌株却没有获得转化