棉酚对迟发型超敏反应小鼠模型Th17Treg细胞亚群影响.docVIP

棉酚对迟发型超敏反应小鼠模型Th17Treg细胞亚群影响 　　摘 要：本论文建立二硝基氟苯（DNFB）所诱发的迟发型超敏反应（DTH）模型。使用流式细胞术检测了棉酚对迟发型超敏反应小鼠脾脏中Treg及Th17细胞亚群的影响。结果显示药物组与模型组相比，耳廓肿胀程度减轻，棉酚组小鼠Th17细胞数量明显下降，Treg细胞数量明显增加，能够调节Th17/Treg细胞失衡。说明棉酚能通过调节Th17与Treg细胞的免疫平衡降低对DNFB所诱发的DTH小鼠免疫反应。 　　关键词：流式细胞术；棉酚；迟发型超敏反应；Th17；Treg；免疫平衡 　　临床上用于治疗自身免疫性疾病的免疫抑制药物种类较多，但却具有不同程度的肝肾毒性或神经毒性等，因此，寻找低毒、有效、价格低廉的免疫抑制药物成为当今医药界一直追寻的目标。棉酚（gossypol，GOS）是一种天然黄色多酚羟基双萘醛类化合物，存在于锦葵科植物棉花的根、茎和种子中。有研究发现，GOS具有抗炎、镇静的作用[1， 2]，但对免疫反应研究还比较少。 　　DNFB所致DTH是典型的Ⅳ型变态反应实验模型，被广泛用于针对自身免疫性疾病药物开发的实验研究[3， 4]。该动物模型模拟DTH的致敏及诱发阶段，这种耳廓皮炎模型具有在诱发时不需要剔除毛发，炎细胞浸润数量多，炎症表现直观等特点，因此可以根据炎症耳廓的厚度及单位面积炎细胞数来判断迟发型超敏反应小鼠的程度。前期工作我们已经证明了棉酚对Th1/Th2免疫失衡的调节作用，本研究在前期的基础上，通过建立DTH小鼠模型，探讨棉酚对模型小鼠Treg细胞和Th17细胞免疫失衡的影响，为进一步研究迟发型超敏反应的作用机制以及棉酚的免疫抑制机理提供理论基础。 　　一、实验材料 　　1.实验动物 　　健康BALB/c小鼠，6周龄，雌雄各半，体重18～20 g。饲养环境温度22±1℃，自由进食，饮水。 　　2.化学试剂 　　荧光标记的抗小鼠CD4、IL-17A、CD25单克隆抗体（BD PharMingen）；荧光标记抗小鼠Foxp3单克隆抗体（eBiosciences）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1%多聚甲醛；RPMI 1640；棉酚。 　　3.主要仪器设备 　　流式细胞仪（美国Becton）；CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司）；AE 30显微镜（日本Olympus）；微量移液器（1000 ?L，200 ?L，10 ?L）（美国Thermo公司）；AE 160型电子分析天平（瑞士Mettler公司）；XW-100A漩涡混合器（上海精科实业有限公司）。 　　二、方法 　　1.DTH小鼠模型的建立 　　建立小鼠DTH模型，将BALB/c小鼠腹部剃毛，面积约1×1 cm2，使用胶带黏贴数次以使小鼠致敏部位充分暴露。在去毛部位涂5%的DNFB（DNFB 在临用前用4：1的丙酮：橄榄油配制）50 ?L，以单独涂布丙酮/橄榄油溶剂作为空白对照，每天1次，连续2 d，诱导小鼠超敏反应。在致敏后第5 d使用10 ?L的5% DNFB涂布小鼠右耳背进行激发试验。同时将小鼠左耳涂等量的丙酮/橄榄油溶剂作为对照，24 h后DTH小鼠模型建立成功。 　　2.动物分组及给药方案 　　将BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只：空白组、DTH模型组、棉酚（GOS）药物低剂量组，中剂量组，高剂量组。以二硝基氟苯（DNFB）为致敏原，通过两次诱导激活对抗原敏感的T淋巴细胞。从第一次DNFB诱导致敏开始，GOS药物组每天腹腔注射GOS，连续7 d，空白组给予同样剂量的生理盐水。 　　3.HE染色检测耳廓肿胀程度 　　24 h后小鼠脱颈处死，剪下小鼠右耳，将石蜡切为4 mm厚的片，做HE染色，检测DTH小鼠超敏反应程度。 　　4.CD4+ T淋巴细胞分离纯化 　　（1） 磁珠标记。取小鼠脾脏制备脾淋巴细胞悬液，每107个细胞用90 ?L缓冲液重悬细胞，加入CD4磁珠标记细胞，孵育15 min；向其中加入抗CD4抗体，避光4℃孵育5 min；加入PBS洗涤细胞去除残余抗体，离心细胞并弃上清液，使用500 ?L缓冲液重悬细胞。 　　（2） 磁珠分选。将磁珠分选器放入无菌操作台上，将MS柱于固定在分选器磁场中，离心管在MS柱下，使用1 mL缓冲液冲洗MS柱，加缓冲液清洗时小心操作，尽量不要带入气泡；MS柱内加入已经标记好的细胞悬液，收集悬液；冲洗MS柱两次，每次使用500 ?L缓冲液；将MS柱从磁珠分选器上移走，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。向MS柱中加入1 mL缓冲液，立即使用推拉器冲洗，将滞留柱内的磁性标记细胞洗脱出来，此细胞为目标细胞；取目标细胞1 ?L，台盼蓝染液9 ?L，充分混匀并加入到细胞计数板上，染色3 min内进行观察，染