液氮缓慢冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力影响.docVIP

液氮缓慢冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力影响 　　【摘要】 目的：研究和分析快速冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力的影响。方法：从2013年7月-2016年7月所有收集到的精液标本中选取其中的150例精液标本作为本次的试验研究对象，将这150例精液标本按照不同的冷冻方法分为观察组和对照组两组，各75例，对照组采用快速冷冻法进行精液冷冻，观察组采用液氮缓慢冷冻法进行冷冻，冷冻时间超过24 h，观察和分析两组精液标本冷冻前后前向运动（PR）精子数量、精子存活率、精子畸形率，对比两组精子冷冻后复苏率和平均精子活力指数。结果：冷冻前，两组精液PR精子数量、精子存活率、精子畸形率、平均精子活力指数比较差异无统计学意义（P0.05）；冷冻后，快速冷冻方法的精液冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数均显著低于液氮缓慢冷冻复苏后PR精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数，差异均有统计学意义（P0.05）。结论：采用液氮缓慢冷冻法进行精液冷冻会显著提高精液冷冻复苏后的精子前向运动精子数量、精子存活率、精子复苏率和平均精子活力指数，适合在精液冷冻当中应用。 　　【关键词】 精液； 精子活力； 精子冷冻复苏率； 液氮缓慢冷冻方法 　　doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.078 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）07-0162-03 　　精子冻融技术是人类精子库和辅助生殖技术当中的其中一项核心技术，随着近几年来精子冻融技术的不断发展，精子冷冻的方法越来越多[1]。为了给临床实验提供相关方面的研究依据，本文对液氮缓慢冷冻方法对精液冷冻复苏后精子活力的影响进行简要的探究和分析[2]。具体如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　从2013年7月-2016年7月所有收集到的精液标本中选取其中的150例精液标本作为本次的试验研究对象，这150例精液标本均得到本人的知情同意，这150例捐精志愿者年龄23～36岁，平均（29.37±7.63）岁，这150例捐精者均在取精前禁欲2～7 d，精液量2～5 ml，并且在15 min内将精液完全液化，将这150例精液标本按照不同的冷冻方法分为观察组和对照组两组，各75例。所有精液标本在冷冻前的精子数都≥15×106/ml，正常形态的精子≥4%，前项运动PR精子数≥32%。两组精液标本精液量、冷冻时间、冷冻前精子浓度、冷冻剂的使用、PR精子数和正常形态精子、捐精者年龄等方面比较差异均无统计学意义（P0.05），可对比。 　　1.2 冷冻试剂 　　本次精液冷冻所选的冷冻保护剂是GYC型冷冻保护剂，这种冷冻保护剂的成分包括5%葡萄糖溶液37.4 ml，2.9%枸橼酸钠溶液58.6 ml，甘油56.0 ml，蛋黄48 ml，pH值为7.2的庆大霉素0.5 ml，精液与冷冻剂的比例为3：1[3]。 　　1.3 方法 　　1.3.1 精液的冷冻方法 按照精液与冷冻剂的比例将加入同一精子冷冻培养基的精液装入冻存管中，并保证培养基和精子细胞能够混合并保持彻底平衡，然后将冻存管卡在金属杆的夹子上，将冻存管分为两组，分别根据快速冷冻法和液氮缓慢冷冻法进行冷冻，其中快速冷冻法是将冻存管直接浸入温度为零下195 ℃的液氮罐当中；液氮缓慢冷冻法是先将冻存管放置到温度为4 ℃的冰箱中，放置时间为5～10 min，将其取出后放置到液氮蒸汽当中熏10 min，然后再从液氮蒸汽中取出冻存管将其浸入到零下196 ℃的液氮罐中[4]。两组精液的冷冻时间要超过24 h。 　　1.3.2 精子的解冻方法 将冻存管从冰箱中取出，并将取出的冻存管从35 ℃的水温中进行水浴，直至冻存管完全溶解。把解冻后精子溶液倒入事先准备好的试管当中，然后缓慢的以一滴一滴的方式?⑷?份精子冲洗培养基和精子溶液进行彻底的混合，确保精子冷冻培养基能够被完全稀释，需要注意的是这一操作要在30 s内完成[5]。然后取300 g精子溶液进行持续10 min离心后，将上面的清水弃除掉后，再加入适量的精子冲洗培养基，直到试管内的精子溶液大约为0.5 ml，进行精子的重悬，然后对精液进行分析，并检测前向运动（PR）精子浓度、精子复苏率和平均精子活力[6]。 　　1.4 观察指标及评价标准 　　本次对精液的分析根据《世界卫生组织WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版中的相关规程进行精液的常规分析和精子形态学的分析，观察和分析的内容包括精液量、前向运动（PR）精子浓度、精子复苏率和平均精子活力[7-8]。精子存活率分析方法：将20μl的精液标本和5 g/L的伊红Y溶液按照1：1的比例混合均匀后，覆盖上盖玻片，静置30 s后采用400倍的光学显微镜进行观察，其中活精子不着色，