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甘薯愈伤组织及其再生丛生芽诱导试验研究 　　[摘要]以甘薯品种红心王为材料，通过正交实验，筛选出了甘薯愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA，外植体为茎段；通过在不定芽诱导培养基MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT中添加AgNO3，提高了愈伤组织的分化率，并且诱导出再生丛生芽，其中AgNO3的最佳含量为4mg/L。实验显示，诱导出的不定芽可以在MS培养基中多次继代，实现扩繁。 　　[关键词]甘薯 组织培养 愈伤组织诱导 丛生芽诱导 正交试验 　　中图分类号：Q94 文献标识码：A 文章编号：1671－7597(2008)1010009－02 　　 　　甘薯的组织培养是一个重要的研究领域，已在甘薯的快速繁殖、脱病毒及遗传改良等领域得到了较广泛的应用。在甘薯的组织培养中，一般要经过愈伤组织诱导，然后通过形态发生(器官发生或体细胞胚胎发生)再生出完整植株[1、2]。目前，虽然已由甘薯的叶片、叶柄、茎段、块根、茎尖等外植体诱导出愈伤组织并再生出植株，但分化的不定芽都是单个芽，没有再生丛生芽的分化。据张鹏[3]等报道，AgNO3可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎发生；可以促进一些再生困难种芽的产生；可以增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。在诱导不定芽的培养基中加入适量的AgNO3可以增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率，并且可诱导出再生丛生芽[4]。 　　 　　一、材料和方法 　　 　　（一）植物材料 　　以甘薯品种红心王为材料。 　　（二）试验方法 　　1．试管苗的培养。剪取生长旺盛的茎尖3～5cm，在室内切去叶片，然后消毒。消毒时将材料先用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1遍，然后用HgCl2(0.1%)浸泡8min，无菌水冲洗4遍。接种时，在解剖镜下剥取0.2～0.3mm大小的生长点(带1片叶原基)，接种在MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L IAA+0.1 mg/L GA3培养基上[5]。 　　2．愈伤组织的诱导及增殖培养。取经上述培养获得的无菌苗，在无菌条件下，将叶柄和茎(节间)切成长约0.5～1.0cm的切断，叶片切成切断面积约为0.5cm2的小块，分别接种于附加NAA和BA的MS培养基中。 　　采用3因素各3个水平试验，正交表选用L9(33)，表头设计见表1。正交表中A，B，C分别对应于NAA，BA，外植体3个因素，A，B两因素的3个水平1，2，3分别对应浓度为0.1mg/L，0.5mg/L和1.0mg/L，C因素的3个水平1，2，3分别是叶柄、叶面向上和茎段。正交表和9种培养基及3因素的详细配比见表2。 　　接种20d后，观察愈伤组织的质地、色泽和生根情况，统计外植体愈伤组织的诱导率，并测量愈伤组织的大小，对试验结果进行分析[6]。 　　将诱导的愈伤组织移栽到MS培养基中进行增殖培养。 　　 　　表1 L9(33)正交试验表头设计表 　　 　　3．不定芽的诱导。将增殖培养的愈伤组织分别移栽到MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT和MS+0.02mg/L2,4-D+1.0mg/L KT+AgNO3(AgNO3的含量依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L)两种培养基上，进行愈伤组织不定芽的分化，统计愈伤组织分化率。 　　（三）培养条件 　　培养温度为28±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d，pH = 5.6～5.8。 　　 　　二、结果与分析 　　 　　（一）甘薯组织培养愈伤组织诱导正交试验L9(33)的试验结果见表2 　　 　　表2 甘薯组织培养L9(33)试验结果 　　 　　（二）甘薯外植体愈伤组织的诱导和生长 　　培养3d后，外植体的切口处膨大，尤其以叶柄最为明显，6d左右，切口处出现肉眼可见的浅黄色愈伤组织。随后，愈伤组织继续生长，在茎段和叶柄外植体两端形成愈伤组织块，而使其呈哑铃状，在叶片的四周切口出现带状愈伤组织。 　　试验结果表明（表2），激素种类及浓度和外植体的类型对愈伤组织的诱导均有明显影响，所诱导的愈伤组织在颜色、质地等方面都表现出明显的差异，随着BA浓度的增高，愈伤组织生长有不断增加的趋势，实验筛选出愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0mg/L NAA+0.5mg/L BA，外植体为茎段。 　　（三）愈伤组织的继代增值培养 　　将诱导的愈伤组织移栽到MS培养基中，水浸状的愈伤组织生长缓慢，逐渐褐化；致密状的愈伤组织生长良好，表面带有白色颗粒，但生长缓慢；疏松状的愈伤组织增殖速度最快，是其它愈伤组织的2～3倍，且增殖后仍保持浅绿色、质地疏松、颜色鲜艳，在MS培养基中连续继代培养多次，生长