滇桂艾纳香多糖分离纯化及单糖组成分析.docVIP

滇桂艾纳香多糖分离纯化及单糖组成分析 　　摘要以滇桂艾纳香干燥全草为原料，以水为溶剂提取多糖BRP，经过D101大孔树脂脱色，DEAE纤维素柱分离，依次用水和0.15，0.3，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，得BRP0，BRP1.5，BRP3和BRP4四个洗脱部分；将BRP0，BRP1.5采用Sevage法脱蛋白、活水透析和Sephadex G15柱层析，再经琼脂糖Sepharose 6FF柱层析分离纯化，得到BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五个组份；GPC检测其相对分子质量、分子质量分布及峰型，确定它们为均一组分多糖；HPLC分析结果显示，BRP0和BRP1.5主要由鼠李糖、果糖和半乳糖组成，其物质的量之比大致为：1.00∶0.962∶0.392和1.00∶1.125∶0.584. 　　关键词滇桂艾纳香多糖；DEAE纤维素分离；凝胶色谱纯化；HPGPC检测；单糖分析 　　中图分类号R284文献标识码A文章编2017 　　滇桂艾纳香（Blumea riparia （BL.） DC）为菊科艾纳香属植物的干燥全草，又名假东风草，多见于云南和广西交接部，生于山草坡地或灌木丛中[1]，其味甘、温、无毒，具有活血散瘀、祛?L除湿、利水作用，在广西民间有几百年的药用历史，常用于妇女经期提前、产后血崩、浮肿、骨痛、受凉腹痛、腹泻等多种妇科常见疾病的防治[2].以滇桂艾纳香为原料的乙醇溶液提取物制成的中成药――妇血康颗粒，已用于临床，疗效显著；研究表明，其水提取物也具有显著的止血活性功效[34]，但是其有效成分及其含量、药理作用均不是非常明确；因此，本文对其水提多糖（Blumea riparia Polysaccharides， abbreviated as BRP）成分进行提纯，并对多糖的组分进行分析[56]，为进一步研究妇血康颗粒制剂的药理和作用机制打下基础. 　　1仪器与方法 　　1.1材料与设备 　　滇桂艾纳香干燥全草，广西桂西制药有限公司；DEAE纤维素，上海恒信化学试剂有限公司；Sephadex G15和Sepharose 6FF 生化试剂，南京森贝伽生物科技公司；葡萄糖（AR），上海医药公司；果糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸（生化试剂），上海伯奥生物科技有限公司；RC451k透析袋，上海绿岛科技发展有公司；硫酸、苯酚、无水乙醇、丙酮等均为国产AR试剂. 　　Nexus 470型FTIR红外分光光谱仪（Nicole，America）；Agilent 1260高效液相色谱仪（America）；Agilent Technotgies 1200 GPC System（America）；UV265FW紫外可见分光光度计（Shimadzu Japan）；DZF6020真空干燥箱（河南巩义科技仪器公司）；ALPHAL型真空冷冻干燥机（Germany）. 　　1.2实验方法 　　1.2.1滇桂艾纳香干燥全草多糖BRP的提取、分离、纯化 　　（1） 提取取滇桂艾纳香干燥全草5 kg，粉碎，过282 μm筛，称其碎片3.0 kg，加无水乙醇回流提取多次，除去脂溶性成分，药渣以蒸馏水为溶剂，用微波提取器（1 kW，10 L）在85 ℃下提取3次，每次20 min；提取液离心去杂、减压浓缩约至原体积的1/5，加乙醇至含醇80%左右，冰浴放置过夜，离心，得BRP沉淀物.BRP用无水乙醇多次浸提，去除残余脂溶性物质和部分色素. 　　（2） 脱色将上述BRP配成稀水溶液，直至沉淀物不再溶解，过滤，取滤液过D101大孔树脂，用水洗脱，直至洗脱液颜色浅淡，收集水洗脱液，浓缩[7]. 　　（3） 分离将上述浓缩液进行DEAE纤维素柱层析[89]，依次用蒸馏水和0.15，0.30，0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，用苯酚硫酸显色检测，收集各梯度洗脱液. 　　（4） 脱蛋白对各收集液采用Sevage法（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1）多次脱蛋白至紫外260～280 nm处无明显吸收峰为止[10]. 　　（5） 透析脱蛋白后的BRP溶液装入GRC451k透析袋内，活水透析72 h以上. 　　（6） 脱盐透析后的BRP溶液过Sephadex G15柱层析，脱除BRP溶液中残留的盐，收集BRP溶液. 　　（7） 凝胶纯化将透析的BRP0和BRP1.5溶液浓缩，过0.45 μm微孔滤膜，经琼脂糖凝胶Sepharose 6FF层析，蒸馏水洗脱，自动部分收集器收集，苯酚硫酸显色检测，绘制洗脱曲线，根据峰型合并各洗脱部分，冷冻干燥，得BRP01，BRP1.51，BRP1.52，BRP1.53和BRP1.54五个组分. 　　1.2.2BRP性质