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猪akirin2基因组织表达谱及序列分析 　　摘要：克隆猪的akirin2基因，并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp（GenBank登录号KCl40110.1），推测的氨基酸序列包含203个氨基酸，为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析，用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示，猪akirin2基因在脑组织中高表达，在淋巴、睾丸中表达量相对较低，在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示，猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高，均为96%，与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现，存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28，推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上，几个不同物种的akirin2蛋白分成3支，结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近，与鸡的亲缘关系最远。 　　关键词：猪；akirin2基因；克隆；组织分布；序列分析；基因功能 　　中图分类号：S828.2 文献标志码：A 文章编号：1002―1302（2016）01―0025―04 　　在畜牧业中，肌肉的产量和质量是肉用畜禽的重要经济性状，对畜禽饲养业的经济效益起决定性作用。肌细胞的发育开始于成肌细胞或前体细胞。成肌细胞经过分化和融合过程形成肌管，其随后进一步分化成肌纤维。肌肉抑制素（my-ostatin，MSTN）（或生长分化因子8，GDF-8）是一种调节肌肉生长和发育的主要因子，MSTN表现出对肌肉生长的负调节。肌肉抑制素基因中11 bp的缺失在牛中导致比利时蓝（belgian blue）或双臀肌（double-muscled）表型，比利时蓝牛在肌肉质量上增加20%～30%。尽管在遗传分析中已经揭示出MSTN的重要功能，然而对MSTN信号通路下游调控肌肉发生的相关基因的了解还不多。akirin是Miner等通过小鼠消减抑制杂交文库筛选出的MSTN下游调控基因。这一新核蛋白基因的发现，填补了MSTN调控肌肉生成的上下游基因的空缺。在脊椎动物中akirin基因非常保守，至少存在akirin1和akirin2等2个同源基因。然而，在鸟类和爬行动物中没有akirin1??只有akirin2基因，在硬骨鱼中akirin基因家族有2～8个成员，在细菌、植物和酵母中均未发现有akirin的存在。张志强等首次克隆到猪的mighty（akirin1）基因，并对该基因在猪不同组织中的表达谱进行分析。本研究克隆猪的akirin2基因，并对其组织分布及序列特征进行分析，为进一步研究该基因的功能奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1样品采集 　　取健康猪的心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、直肠、大脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴、下颌、子宫、睾丸等18个组织，用锡箔纸包好迅速冷冻于液氮中，置于-80℃低温冰箱保存备用。 　　1.2主要试剂与仪器 　　Trizol（Invitrogen）；DEPC（Serva）；Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H_）、RNase inhibitor、dNTP-mix、Premix TaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker、凝胶回收试剂盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）、pMDl9-T Vector均购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5ct菌株为笔者所在实验室保存。台式高速离心机（Eppendorf，Germany）；温度梯度PCR仪（sensoquest，Germa-ny）；凝胶成像系统（Alphalmager HP，USA）；微量核酸蛋白检测仪NanoDrop-100（Thermo，USA）。 　　1.3方法 　　1.3.1引物设计 根据NCBI上GenBank中小鼠和人的aki-rin2基因序列，在GenBank数据库中对猪的ESTs和UniGene数据库进行搜索，对搜索到的ESTs序列进行拼接，结合软件BIOXM2.6及引物设计软件，设计1对引物[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]：akirin2-F，5′-ATGGCGTGCG-GAGCTACTCTG-3′；akirin2-R，5′-TCATGAAACATAAC-TAGCAGGCTG-3′。 　　1.3.2总RNA的提取及cDNA的合成 取50～100 mg经液氮处理过的大脑组织，