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硫代CpG ODN对CEF增殖能力影响 　　摘 要：为了明确硫代CpG ODN对CEF增殖能力的影响，将CpG ODN2006进行硫代修饰，与CEF共孵育，测定了不同浓度和时间条件下细胞的增殖率。结果表明： CEF对硫代CpG ODN的耐受值为80 μg/mL；20 μg/mL硫代CpG ODN作用24～120 h，CEF均能够增殖，且48～72 h增殖效果最为显著。该结果为进一步研究CpG ODN激发CEF免疫应答效果和体外筛选体系的建立奠定了基础。 　　关键词：CpG ODN；硫代修饰；CEF；增殖 　　中图分类号：S852.5+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0108-03 　　Abstract In order to confirm the influence of phosphorthioate CpG ODN on proliferation of CEF， the cell proliferation rates were measured at different concentrations and times as CEF was treated with phosphorthioate CpG ODN2006. As a result， the tolerance value of CEF to phosphorthioate CpG ODN was 80 μg/mL. When incubated with phosphorthioate CpG ODN of 20 μg/mL for 24 to 120 hours， the CEF all was in proliferation condition， among which， the effect between 48 to 72 hours was significant. The results would provide a basis for further studies on CEF immune response stimulated by CpG ODN and the screening of CpG ODN in vitro. 　　Key words CpG ODN； Phosphorthioate； CEF； Proliferation 　　CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）是含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的核苷酸序列，能够在机体内诱生强烈的免疫反应[1]，配合常规和新型疫苗使用能显著增强疫苗免疫效果，是目前新型免疫佐剂研究热点之一[2]。CpG ODN的硫代修饰能够增强对细胞的刺激效果[3]，防止水解酶的降解，但相关研究表明，硫代修饰会产生一定的非特异性细胞毒性作用，对细胞产生损伤，超过一定浓度时细胞表现为免疫抑制[4，5]。因此，以细胞模型研究硫代CpG ODN功能时，首先要明确其对培养细胞增殖和存活能力的影响，筛选合适的工作浓度。 　　鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast ， CEF）具有容易获得、增殖能力强、适应性强、耐受性良好、性状稳定的特点，广泛应用于分子和细胞生物学的研究[6]。CEF与鸡体的免疫应答模式类似，能够最大化模拟鸡体的反应，可作为研究动物机体反应的起点[7]。为了建立利用CEF体外筛选鸡特异性CpG ODN活性分子的体系，本研究将硫代CpG ODN与CEF共培养，明确其对CEF增殖能力的影响，为体外筛选体系的建立提供研究基础和数据支持。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　9日龄SPF鸡胚购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心；CpG ODN选择对鸡有良好刺激效果的CpG ODN2006（5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′），由上海生工合成，全链硫代修饰。 　　胎牛血清、DMEM细胞培养液、MTT、DMSO购自Gibico；胰酶购自Sigma；96孔细胞培养板购自Coster；青链霉素双抗购自TaKaRa。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 CEF的制备 取9日龄SPF鸡胚1枚，去掉胚体的头、四肢、内脏等，无血清DMEM培养液清洗后剪成碎块，然后再次清洗并弃去洗涤液。加入胰酶进行消化，待组织块变松后加入含10%血清的DMEM反复吹打，使组织均匀。取上清经100目细胞筛过滤，滤液即细胞悬液，细胞计数板计数后加入细胞培养液进行培养。 　　1.2.2 硫代CpG ODN浓度对CEF毒性的测定 将制备的CEF密度调整为5×106个/mL，加入96孔细胞板，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，使CE