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纤维素酶系基因克隆与序列分析 　　摘要： 根据GenBank已报道的枯草芽孢杆菌的基因序列，设计特异性引物，经PCR分别从B.subtilis L、B.subtilis K基因组中扩增得到3个纤维素酶基因序列，基因片段分别长约700、1 500、1 700 bp。连接到T载体上进行测序，获得该3个纤维素酶基因片段的DNA序列，在线比对分析表明3个基因的部分碱基序列与已报道的纤维素酶基因的序列同源性达99%。这3个基因的全序列在GenBank中未见报道，且通过软件对比，三者没有任何相似性。根据3个纤维素酶基因的来源分别命名为Lcen、Ken、Kkg。借助软件分析确定Lcen基因全长699 bp，基因序列为1个完整的阅读框，连续编码232个氨基酸。Ken基因全长1 500 bp，连续编码499个氨基酸。Kkg基因全长1 686 bp，基因序列为1个完整的阅读框，连续编码561个氨基酸。3个基因均属于纤维素酶家族大类。 　　关键词： 纤维素酶；基因；克隆；序列分析 　　中图分类号： Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0040-04 　　纤维素是地球上最丰富的可再生自然资源[1]。全球每年纤维素产量达2 000亿 t[2]，仅我国秸秆产量就达5亿～7亿t，大部分被焚烧、丢弃，不仅浪费资源，而且会对环境造成污染[3]。纤维素是一种无色、无味的白色丝状物，难溶于一般的有机溶剂及水，是植物细胞壁的主要组成部分。植物纤维素结构基本由结晶区域、无定型区域组成，纤维素结晶区域比无定型区域难降解[4]。酶解法是目前降解纤维素最有效的方法[5]。纤维素酶是能够分解纤维素、最终将其降解成葡萄糖的一类酶的总称。根据纤维素酶催化反应功能的不同可将其分为：（1）内切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键；（2）外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键；（3）β-葡萄糖苷酶，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子[6]。纤维素酶分子多数由球状的催化结构域（catalytic domains，CD）、连接桥（linker）、纤维素结合结构域（cellulose-binding domains，CBD）3个部分构成[7-9]。纤维素酶分布广泛，目前饲料用纤维素酶主要从微生物中获得。随着分子生物学、基因工程技术的发展，对纤维素酶分子层面研究也随之展开，纤维素酶基因的克隆与表达成了研究焦点。细菌、真菌的纤维素酶系不断被人们发现、分离，大量纤维素酶基因得到克隆、表达，丰富了纤维素酶的研究材料[10]。结构功能完整的纤维素酶基因克隆到高效表达载体上再进行异源表达，能使纤维素酶的产量成倍提高[11]。本试验对纤维素酶系内的3个纤维素酶基因进行克隆和序列分析，旨在为后续高效联合表达纤维素酶系基因进行研究准备。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与质粒 Bacillus subtilis K、Bacillus subtilis L均由实验室筛选并保存，大肠杆菌DH5α购于北京天根生化科技有限公司，pGEM-T Easy Vector System购于Promega公司。 　　1.1.2 主要试剂 DL 2000 Marker、溴酚蓝、琼脂糖购自北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNTP、各种限制性内切酶购自Promega公司；溴化乙锭（EB）、抗生素（Amp）购于北京索莱宝科技有限公司；RNA酶，蛋白酶K购于北京中科瑞泰生物科技有限公司；琼脂粉、蛋白胨购于Oxid公司。基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒均购自于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。 　　1.1.3 引物 试验中的3对引物序列： 　　ENF： 5′-ATGAAACGGTCAATCTCTATT-3′； 　　ENR： 5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3′； 　　CENF：5′-ATGAAAAAGATCATGAGTGCAT-3′； 　　CENR：5′-TTATTCAGGAAACTGAACATGG-3′； 　　KGF：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′； 　　KGR：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′。 　　1.2 方法 　　LB培养基的配制：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，固体LB培养基加入20 g琼脂粉，120 ℃高压灭菌30 min。细菌基因组DNA的提取、质粒DNA的提取、DNA的凝胶回收参照试剂盒提供的说明进行。纤维素酶基因的PCR扩增、纤维素酶基因片段与T载体的连接、重组质粒导入感受态细胞、含纤维素酶基因的重组质粒的酶切鉴定参照《分子克隆试验