茵栀黄注射液抗胆汁淤积药效成分筛选及其作用机制研究お.docVIP

茵栀黄注射液抗胆汁淤积药效成分筛选及其作用机制研究お 　　[摘要]筛选茵栀黄注射液中的主要药效成分，评价其调节胆汁酸代谢相关基因，发挥护肝作用的机制。选用雄性健康ICR小鼠30只，分为6组：正常对照组、模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组。检测肝功能、肝组织病理学变化以及胆汁酸代谢相关基因的表达。绿原酸组小鼠血清ALT，AST，ALP，TBA水平分别为（1589±253），（1832±256），（2638±987） U?L-1，（4063±767） μmol?L-1，栀子苷组小鼠分别为（2054±236），（2428±519），（3509±503）U?L-1，（4286±711） μmol?L-1，均低于模型对照组（5952±1094），（12837±1797），（16952±962） U?L-1，（13250±3300） μmol?L-1。肝组织病理学分析显示，绿原酸组、栀子苷组小鼠肝细胞的坏死、炎性细胞浸润程度与模型对照组比较均显著减轻。荧光定量QPCR检测显示，给予绿原酸、栀子苷治疗后，胆汁酸代谢相关基因mRNA的变化较模型对照组均发生了代偿性的逆转。茵栀黄注射液中的绿原酸和栀子苷能有效改善胆汁淤积、肝功能及肝脏病理性损伤，并逆转ANIT引起的胆汁酸代谢相关基因mRNA变化，从而起到肝保护作用。 　　[关键词]茵栀黄注射液；绿原酸；栀子苷；胆汁酸代谢；肝内胆汁淤积 　　茵栀黄注射液由茵陈、栀子、金银花、黄芩等4 味中药组成，具有清热、解毒、利湿、退黄疸和降低转氨酶的作用[14]，临床广泛用于治疗胆汁淤积。茵栀黄注射液作为复方制剂，由于其配伍成分组成复杂，其具体药效成分及药理学机制尚不清楚。前期，本课题组采用LCMSITTOF分析技术，归属推导了24种成分，初步鉴定了茵栀黄注射液中的化学成分黄芩苷、绿原酸、栀子苷、黄芩素、汉黄芩苷、栀子酸、新绿原酸、咖啡酸、滨蒿内酯等[56]。其中，黄芩苷、绿原酸、栀子苷是含量较多的组分， 本研究将对这几种主要成分的药效活性进行筛选。 　　近年来，随着分子生物学的发展，对胆汁淤积疾病的分子生物学相关机制的研究也进一步深入。现已研究证实，分布于肝细胞膜血管侧膜转运体 Na+牛磺胆酸共转运多肽（Ntcp）、有机阴离子转运多肽2（Oatp2）及胆管侧膜转运体多药耐药相关蛋白2（Mrp2）、胆盐输出泵（Bsep）对胆酸盐及胆红素的转运具有重要作用[79]。因此，对胆汁酸代谢相关酶及转运体的研究成为治疗胆汁淤积的新方向。 　　绿原酸是茵陈的主要成分，有促进胆汁分泌和清热解毒等功效。研究发现，绿原酸对CCl4引起的肝毒性有明显的保护作用[10]。栀子苷作为栀子的主要成分，对酒精引起的急性肝损伤有一定保护作用[11]。研究报道黄芩苷固体分散体对小鼠D氨基半乳糖急性肝损伤有一定保护作用[12]。滨蒿内酯作为茵栀黄中的成分之一，能够通过激动CAR受体提高胆红素清除率[13]。本实验通过ANIT诱导肝内胆汁淤积小鼠动物模型，研究茵栀黄中的主要成分绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯等对ANIT诱导胆汁淤积的治疗作用以及对胆汁酸代谢相关转运体表达的影响，以期从分子水平探讨茵栀黄中主要成分的作用机制及靶点，为基于传统中药天然活性成分的发展提供理论基础。 　　1材料 　　α异硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司）；绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯（中国食品药品检定研究院）；定量PCR试剂（SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司）；定量PCR仪（LightCycle 480，Roche公司）；肝功能有关试剂盒（长沙永和阳光科技有限公司）。 　　雄性健康小鼠30只，体重（20±5）g，宁波大学实验动物中心提供，许可证号SYX所有动物饲养于宁波大学实验动物房，室温恒定，经过适应性喂养，饮食、饮水正常者，无不良反应，即纳入实验。 　　2方法 　　21动物实验 　　雄性小鼠30只，随机分为正常对照组、模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组，每组各5只。绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组分别灌胃绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯（50 mg?kg-1?d-1，其中，绿原酸、黄芩苷、滨蒿内酯溶解于玉米油中，栀子苷溶解于生理盐水中），共计5 d。第4天，模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组分别采用ANIT灌胃1次（75 mg?kg-1），诱发小鼠急性肝内胆汁淤积病变。同时各组继续分别灌胃绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯，共计5 d，ANIT灌胃48 h后所有小鼠处死。 　　22标本采集及保存 　　小鼠于眼眶采血后，15 mL离心管收集血液，并脱颈处死。将其固定在手术台上，剪去腹部鼠毛，将腹部皮肤及皮下组织一并剪