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苦菊提取物对HepG2细胞抗氧化作用及其机制研究 　　[摘要] 目的：考察苦菊提取物（CEE）对H2O2致HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用，并探讨苦菊提取物在HepG2细胞中抗氧化作用机制。方法：通过MTT法和DCFH-DA荧光染色，检测H2O2处理HepG2细胞的活性和胞内ROS水平；在抗氧化反应元件（ARE）报告基因转染稳定的HepG2细胞内检测ARE-Luciferase活性；并通过荧光定量RT-PCR测定HepG2细胞内含有ARE序列相关基因的mRNA表达水平。结果：H2O2处理HepG2细胞后，细胞存活率下降，胞内ROS水平上升，而加入不同浓度的CEE则可明显改善上述结果。不同浓度的CEE处理转染ARE报告基因的HepG2细胞，可使细胞内的ARE活性呈浓度依赖性增强。此外，CEE可使HepG2细胞中含ARE序列的调控基因GCLC，GCLM和HMOX-1的mRNA表达水平上调，并呈浓度依赖性。结论：CEE通过降低ROS水平，抑制H2O2诱导的HepG2细胞损伤，而CEE对HepG2细胞的抗氧化保护作用机制可能与其激活HepG2细胞内Nrf2-ARE通路相关的抗氧化防御系统密切相关。 　　[关键词] 苦菊；活性氧；抗氧化反应元件；肝保护 　　根据《中国植物志》的记载，菊苣属植物在我国主要有3种：菊苣Cichorium intybus、腺毛菊苣C. glandulosum Boiss和苦菊C. endivia L.，其中前2种被列入我国药典，其具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿的功效。现代药理学研究还发现，它们具有抗菌和护肝作用，并在治疗高脂血症、糖尿病及高尿酸血症等代谢性疾病方面具有潜力[1-3]。相比之下，苦菊虽然与它们化学成分相近，却鲜有相关药理作用的报道。但随着苦菊在我国的大面积种植栽培，它的药用开发值得关注。 　　苦菊的学名是栽培菊苣，又称苦苣，是一种栽培植物，在欧洲是深受喜爱的健康食品，其营养成分与其抗氧化活性有关[4]。有文献报道，包括栽培菊在内的苣菊属植物水溶液具有清除自由基、有效预防机体组织的氧化应激损伤的能力[5-6]。此外，本课题组的前期工作发现，苦菊提取物（CEE）具有清除体外DPPH?和O 　　2等自由基的作用，在细胞和动物水平上具有保护肝细胞损伤的功效，其作用机制可能与抗氧化作用有关[7-8]。本研究将在HepG2细胞水平上进一步探讨CEE的抗氧化机制。 　　1材料 　　1.1提取物制备 苦菊购自北京新发地蔬菜批发中心，经中国医学科学院药物研究所马林老师鉴定为菊科菊苣属植物栽培菊苣C. endivia。配备过程如下：苦菊干燥全草5.8 kg经95%乙醇回流提取3次（80 L×2 h，70 L×1 h，68 L×1 h），过滤合并滤液，减压浓缩所得浸膏混悬于70%乙醇溶液中。混悬液继续经石油醚萃取4次（2，1.5，1.5，1.5 L），所得到的乙醇层经减压浓缩至无醇味，加水混悬约2.3 L，并经乙酸乙酯萃取3次 （1.5，1.2，1.2 L），萃取后所得的水层约2.2 L，过大孔吸附树脂，其中60%乙醇部分浓缩后挥干得到重约40 g的棕色粉状颗粒，即为CEE。本实验室对CEE进行分离和结构鉴定，初步发现了5个化合物，它们分别是2-糠醇-（5′→11）-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉，山柰酚，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，腺苷和苯乙醇葡萄糖苷，其中2-糠醇-（5′→11）-1，3-环戊二烯并[5，4-c]-1H-噌啉为新发现的化合物，山柰酚及其衍生物可能是CEE的主要抗氧化活性成分[8]。以山柰酚及其衍生物为目标物，CEE的提取率为17%。每次用时称取适当样品，实验前用不含血清的培养液稀释成所需浓度，0.22 μm滤膜过滤后，用于体外实验。 　　1.2试剂 MTT和DCFDA均购自Sigma-Aldrich公司；过氧化氢（H2O2，30%）购自国药集团化学试剂有限公司；Cignal慢病毒ARE基因报告子试剂盒由美国SABiosciences公司提供；Luciferase报告基因检测系统由美国Promega公司提供；TRIzol 购自Invitrogen公司；含有MuLV逆转录酶和寡核苷酸引物系统和SYBR Green试剂盒由Applied Biosystem公司提供。 　　1.3仪器 UV-260紫外分光光度计（日本岛津）；Spectra Max190酶标仪（美国Molecular Devices）；Spectra Max Gemini XS荧光酶标仪（美国Molecular Devices）；IX-70荧光倒置显微镜（日本Olympus）；ABI PRISM 7900荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems）。 　　2方法 　　2.1