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苦豆子愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系建立 　　摘要：以苦豆子子叶和胚轴为材料，对苦豆子愈伤组织诱导和继代增殖的最佳培养条件进行研究，旨在建立苦豆子悬浮细胞体系。结果发现，子叶和胚轴为愈伤组织生成的最佳外植体，愈伤组织最佳诱导培养基是MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳继代增殖培养基是MS+1.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。以胚轴诱?У挠?伤组织是细胞悬浮培养的理想材料，初始接种量10%～20%，添加3%蔗糖，有利于悬浮细胞体系的生成。 　　关键词：苦豆子；愈伤组织；悬浮培养；子叶；胚轴；诱导培养基；继代增殖培养基；初始接种量 　　中图分类号： S567.904.3文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）14-0027-04 　　苦豆子（Sophora alopecuroides）豆科槐属，是我国西北荒漠区广泛分布的一种重要沙生药用植物[1]，以全草、根、种子入药，味极苦，性寒，民间用其根治喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等[2]。喹诺里西啶生物碱和类黄酮是其重要的活性成分，已有研究报道，喹诺里西啶生物碱是一种安全无毒的生物杀虫剂，在医药上苦豆子具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫、增强免疫等多种生理活性[3]。通过刈割苦豆子植株提取有效活性物质是目前常用的方法，但苦豆子野生资源有限，且不利于人工栽培，势必造成野生资源枯竭，影响生态平衡[4]。因此，合理开发利用苦豆子资源是其长足发展的重要途径。 　　植物细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。目前，利用悬浮细胞培养来生产次生代谢物已广泛应用于各类药用植物中。1997年，许建锋等首次开展了高山红景天悬浮细胞培养[5]。2010年，姜新超对岷江百合进行愈伤组织的诱导时发现，悬浮细胞系建立的关键在于挑选适于悬浮细胞培养的愈伤组织[6]。2014年，赵继鹏等建立了曼地亚红豆杉细胞悬浮体系，发现接种量和激素配比起着至关重要的作用[7]。迄今为止，国内外有关药用植物悬浮细胞培养方面的研究越来越多，红豆杉、甘草、半夏等都有相关的报道[8-10]。关于苦豆子愈伤组织培养已有大量报道，但暂无人建立苦豆子悬浮细胞系。本研究以苦豆子发芽籽粒的子叶、胚轴和胚根为外植体，研究苦豆子愈伤组织诱导、继代增殖培养条件，建立苦豆子悬浮细胞培养体系，为进一步研究苦豆子悬浮细胞培养生产次生代谢产物奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　野生苦豆子豆荚采自宁夏灵武白芨滩国家自然保护区。 　　1.2方法 　　1.2.1愈伤组织诱导培养 　　1.2.1.1不同外植体对愈伤组织诱导的影响 　　挑选饱满、无病害虫蛀的苦豆子种子，80%硫酸浸泡2 h软化种皮，无菌水冲洗并浸泡2 h。用体积分数为75%的乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3次，5%次氯酸钠溶液浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于铺有无菌滤纸的培养皿中，温度为（25±2） ℃，暗培养24 h后，光周期为12 h/d，培养3～5 d催芽。将子叶、胚轴和胚根用灭菌刀划上切口后，接种于添加激素（0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D）的MS培养基上诱导愈伤组织。每种处理接种60块外植体，上述培养条件培养25 d后统计愈伤组织的诱导率，观察愈伤组织的生长状况。愈伤组织诱导率=诱导愈伤组织数/接种组织数×100%。 　　1.2.1.2不同激素配比对苦豆子愈伤组织诱导的影响 　　将子叶和胚轴分别接种于添加2，4-D（0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、05、1.0 mg/L）组成的26种MS培养基上，每个处理接种60块外植体，在温度为（25±2） ℃、光照时间12 h/d条件下培养25 d，统计愈伤组织的诱导率及其生长状况。 　　1.2.2愈伤组织的增殖培养 　　将生长旺盛的愈伤组织转接至添加2，4-D（0.2、0.5、1.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L）组成的7种MS培养基上进行增殖培养，计算愈伤组织的增殖系数并记录愈伤组织的生长状态。增殖系数=收获鲜质量/接种鲜质量。 　　1.2.3悬浮细胞系的建立 　　选用子叶诱导增殖培养4次的愈伤组织和胚轴诱导生成的愈伤组织，接种于含有“1.2.2”节筛选出的最佳激素配比的MS液体培养基中，100 mL锥形瓶中加入30 mL MS液体培养基，置110 r/min的恒温摇床上，在温度（25±1） ℃下黑暗培养12 h后，光照黑暗交替 1