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胶原蛋白性质分析 　　［收稿日期］2008年6月18日 　　［作者简介］李海青：长春师范学院生物科学专业。 　　 　　［摘 要］胶原蛋白被称为“骨中之骨，肤中之肤”，可以说是真皮层强有力的后盾，其对皮肤的作用不言而喻。胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色。为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生医材料。其应用领域包括生医材料、化妆品、食品工业、研究用途等。?? 　　［关键词］胶原蛋白 羟脯氨酸 比色法?? 　　［中图分类号］Q 　　［文献标识码］A 　　［文章编号］1009－5489(2008)07－0192－02 　　?お? 　　胶原蛋白(collagen)是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维能使皮肤保持结实而有弹性。它存在于人体皮肤、骨骼、牙齿、肌腱等部位，主要生理机能是做结缔组织的粘合物质。在皮肤方面，它与弹力纤维合力构成网状支撑体，提供真皮层安定有力的支撑。随着年龄的增长，人体胶原蛋白含量会逐渐流失，网状支撑体亦会渐渐变厚变硬、失去弹性，当真皮层的弹性与保水度降低，皮肤便会失去弹性并变薄老化，同时可导致真皮的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象，显出老态。?? 　　胶原蛋白是人体皮肤的主要成分，占皮肤干重70%-80%。医学研究提示；胶原蛋白中的羟脯氨酸是人体皮肤形成的关键物质。“胶原蛋白在结缔组织与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成的网状结构，产生一定的机械强度，是承托人体曲线，体现挺拔体态的物质基础。胶原蛋白还能保持血管壁弹性，防止血管破裂，栓塞。提高关节、软骨以及韧带的润滑，减轻关节僵硬、酸痛、积水等症状。?? 　　现知胶原蛋白可依据分子结构和生物学功能的差异区分为十三种不同类型，其中较主要的有：Ⅰ型，主要存在于成人皮肤和骨组织；Ⅱ型，主要存在于软骨组织；Ⅲ型，主要存在于婴幼儿皮肤或血管内膜；Ⅳ型，主要存在于各组织器官的基底膜。与皮肤生理功能密切相关的主要为Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。?? 　　 　　一、材料与方法 　　?? 　　1.材料?? 　　选用经检疫合格的鱼鳞，清洗干净，去除残留脂肪组织，切成小颗粒或细条状，于－18℃冻藏备用。?? 　　2.仪器?? 　　电子天平，WZF―2102PC紫外可见分光光度计，HHS―2型电热恒温水浴锅等。?? 　　3.试剂?? 　　羟脯氨酸，氯胺T，柠檬酸，氢氧化钠，醋酸钠，正丙醇，对二甲氨基苯甲高氯酸，异丙醇，硫酸等试剂，均为分析纯。?? 　　4.实验方法?? 　　(1)试剂配制?? 　　①pH6.8的柠檬酸缓冲溶液：溶解26.0g柠檬酸C6H8O7 　　，H2 　　O，14.0g氢氧化钠和78.0g醋酸钠于约500ml水中，转移溶液到1000ml容量瓶中。加入250ml正丙醇，用水稀释至刻度。此液于4℃在深色瓶中保存，可稳定几个星期。?? 　　②氯胺T试剂：溶解1.41g氯胺T于100ml如上的缓冲试剂中(现配现用)。?? 　　③对二甲氨基苯甲醛试剂：称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0ml高氯酸［60%(m/m)］，缓慢加入65.0ml异丙醇(现配现用)。?? 　　④羟脯氨酸标准储备液，500ug/ml：准确称取羟脯氨酸标准品50.0mg，用少量水溶解于100ml容量瓶中，加入一滴3mol/L硫酸，定容至刻度。该溶液在4℃下能稳定至少一个月。?? 　　⑤羟脯氨酸标准工作液：吸取5ml羟脯氨酸标准储备液丁500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容(临用前配)，质量浓度为5ug/ml。?? 　　(2)羟脯氨酸标准曲线的绘制?? 　　参照IS03496(E)法［5］，绘制羟脯氨酸标准曲线。?? 　　准确吸取羟脯氨酸标准工作液10.0、20.0、30.0与40.0ml，分别用蒸馏水定容至100ml，此标准溶液的羟脯氨酸浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0ug/ml。?? 　　吸取4ml上述稀释好的溶液于具塞试管中，加入2.00ml氯胺T，摇匀后在室温下放置20min，加入2.00ml显色剂，摇匀后迅速将试管移至60℃的水浴锅中，保温20min，再用流动的自来水冷却试管至少3min，室温下放置30min，最后用紫外可见分光光度计在558±2nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，建立线性回归方程。空白溶液用蒸馏水代替，过程同上。?? 　　(3)样品处理与羟脯氨酸的测定?? 　　称取鱼鳞原料4g左右于锥形瓶中，于105℃硫酸溶液中水解16h，过滤到250ml的容量瓶中，定容至刻度。稀释该溶液中的羟脯氨酸浓度至0.5～2.0μg/ml，再经氯胺T氧化，最后根据氧化后的羟脯氨酸与对二甲氨基苯甲醛反应生成的红色化合物，在波长558