吡硫翁铜抗肿瘤作用及其对硼替佐米的联合增敏效应-药理学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………5 中英文对照表…………………………………………………………9 前 言………………………………………………………………10 材料与方法……………………………………………………………12 结 果………………………………………………………………23 讨 论………………………………………………………………25 结 论………………………………………………………………28 附 图………………………………………………………………29 参考文献………………………………………………………………38 综 述………………………………………………………………42 参考文献………………………………………………………………56 致 谢………………………………………………………………65 原创性声明……………………………………………………………66 学位论文知识产权声明………………………………………………66 关于学位论文使用授权的说明………………………………………66 中文摘 中文摘要 万方数据 万方数据 吡硫翁铜抗肿瘤作用及其对硼替佐米的联合增敏效应 学科 专业：药理学 硕士研究生：宋文彬 导 师：刘金保 教授 中文摘要 背景 蛋白质是参与生命活动的重要物质，维持蛋白质合成与降解的动态平衡是一 切生命保持正常生理功能的必要条件。细胞内蛋白质的降解有两条途径，即溶酶 体途径和泛素-蛋白酶体途径。其中泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin- proteasome pathway, UPP)是真核细胞、古细菌和其他一些细菌胞内降解蛋白 质的通路之一。在真核细胞的细胞核和细胞浆中，80%以上的蛋白质，包括调控 细胞周期、细胞程序性死亡以及感染等重要信号途径的调节蛋白均受此途径的降 解调控。蛋白酶体的主要功能是蛋白质水解作用降解不需要的和损伤的蛋白质， 其生化本质就是通过水解蛋白质的肽键，把大分子的蛋白质水解为短肽片段，进 而影响细胞的增殖、分化、凋亡、DNA 复制和修复、转录和蛋白质控制等。该 通路的功能改变会引起蛋白质降解的异常，进而导致细胞功能的异常。人体的许 多疾病如肿瘤、神经系统疾病等的发生与 UPP 功能异常密切相关，因此 UPP 已 经成为多种疾病治疗的新靶标。研究和开发干扰该途径的药物, 为多种疾病的治 疗提供了新的治疗策略。 目前抗肿瘤的主要策略包括烷化剂、抗代谢物和细胞毒药物，以及与有丝分 裂、拓扑异构酶和酪氨酸激酶相关的抑制剂。金属配合物在药物设计和肿瘤治疗 中展现了独特的性质，顺铂及其类似物作为睾丸癌和卵巢癌最有效的化疗药物应 用于临床一线。但是其存在的毒性也促使新的高效低毒的药物的开发。Q. Ping Dou 等人报道铜的配合物具有抑制细胞 26S 蛋白酶体的功能，为蛋白酶体抑制剂 的开发开辟了新途径。 研究目的 1 广州医 广州医学院硕士学位论文 本研究前期实验表明吡硫翁铜（Copper Pyrithione, CuPT）对细胞上 26S 蛋 白酶体有明显的活性，对纯化的 20S 蛋白酶体则没有抑制效应，提示 CuPT 可能 作用于 19S 进而影响 26S 蛋白酶体活性的。进一步的研究表明 CuPT 对 19S RP 去泛素化酶 USP14、Uch-L5 和 Rpn 11(POH1)具有抑制效应。因此如果将去泛素 化酶 CuPT 和 20S 蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib, Velcade)联合应用将对肿 瘤细胞的泛素-蛋白酶体通路起到双重抑制的效应，从发挥更好的抗肿瘤效应。 实验方法 1、 细胞活力测定：采用 MTS 法检测去泛素化酶抑制剂 CuPT 联合 20S 蛋白酶体抑制剂万珂（Velcade, Vel）对肿瘤细胞活力的影响。 2、 细胞死亡检测：采用 AnnexinV-FITC/PI 双染荧光显微镜观察并拍照记 录 CuPT 联合 Velcade（Vel）对细胞的形态学变化；同时用流式细胞 仪分析细胞死亡情况。 3、 裸鼠载体实验：NCI-H929 接种裸鼠两侧腋下，CuPT 2.5mg.kg-1 腹腔 注射观察并记录给药组和对照组裸鼠体重和肿瘤体积的变化，并在适 当的时候取材。 4、 特定蛋白检测：采用 Western bolt 检测 CuPT 联合 Velcade 对蛋白酶体 系统内源性泛素化蛋白（Ub-proteins, Ub-pros.），泛素-蛋白酶体通路 底物蛋白 c-Jun、IκBα，细胞凋亡相关蛋白 p27、Bax、pro-Caspase 3、 pro-Caspase 8、pro-Caspase 9 及 PARP 的影响。 结果 （一） CuPT