软骨细胞在机械力刺激下细胞骨架及细胞形态改变体外研究.docVIP

软骨细胞在机械力刺激下细胞骨架及细胞形态改变体外研究 　　[摘要]目的探讨周期性的机械应力对大鼠的关节软骨细胞的形态与骨架的刺激作用，为软骨细胞的内力学信号传导机制的临床研究提供参考。方法将体外培养传代至第三代的大鼠软骨细胞置于四点弯曲加力装置周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。对照组静态培养。3d后检测细胞基质合成情况以及微管、微丝、中间纤维的免疫荧光染色，用Western Blot及RT-PCR方法测量cofilin蛋白基因含量。结果加载应力组软骨细胞氨基多聚糖和蛋白多糖的合成与对照组无明显差异（P0.05）；但细胞微管、微丝及中间纤维发生重排，细胞形态和取向趋于一致。实验组cofilin蛋白含量明显高于对照组（P0.05）。结论周期性机械应力改变软骨细胞的形态和细胞骨架，cofilin蛋白在软骨细胞内力学一生物学信号转导中发挥着重要作用。 　　[关键词]软骨细胞；细胞骨架；细胞形态 　　关节软骨处在一个具有压应力、张应力、流体剪切力等机械应力作用的复杂力学环境中，而机械应力在调节关节软骨细胞生物学行为中具有十分重要的作用，能够对软骨细胞新陈代谢进行调控，是保证软骨基质正常状态的必要条件。可调控软骨细胞的新陈代谢，是维持正常软骨基质必不可少的条件。关节软骨组织缺乏血液供应、细胞代谢缓慢、自我修复能力较差，即使较小的软骨损伤也会引起严重的后果。我们的前期动物实验表明，中等强度的炮台运动能促进大鼠软骨缺损的修复重塑，但其作用机制尚不清楚。 　　本研究拟通过体外实验对大鼠关节软骨加载周期性压应力，观察应力下的软骨细胞形态和细胞骨架的变化，为软骨细胞内力一生物信号转化研究提供基础，为适度应力促进关节软骨缺损修复重塑的机制研究提供依据。 　　1.资料与方法 　　1.1一般资料 　　主要包括大鼠来源及所用试剂的来源。本研究中所用大鼠为7d龄，且身体健康，均由南方医科大学实验动物中心提供。主要试剂：鼠抗人Tubulin B单克隆抗体（北京中杉金桥生物进口分装）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培养基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸缓冲液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；链菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番红（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；双乙酸荧光素（Salarbio公司）；甲苯胺蓝（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型胶原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC?思牵ū本┲猩冀鹎派?物进口分装）；I型胶原蛋白裱衬的6孔培养板（Flexercell公司）。 　　1.2仪器设备 　　主要包括四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院研制）；流式细胞仪（Coulter，美国）；CO2培养箱（ShelLab，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；数码相机（Olympus，日本）。 　　1.3实验方法 　　主要包括细胞培养、染色以及检测。 　　1.3.1软骨细胞的分离培养及应力加载 体外分离大鼠四肢的关节软骨并进行传代培养，细胞培养传至第3代，随机分为对照组（A组）和周期性机械应力组（B组）。A组：在正常条件下培养软骨细胞；B组：软骨细胞置于周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。加载应力组细胞卸载后与对照组细胞同时进行以下检测。 　　1.3.2番红及甲苯胺蓝染色 软骨细胞生长于柔性的硅胶膜上，选择PBS进行冲洗，并加入0.25%番红以及1%甲苯胺蓝染液，在室温条件下，进行孵育2h。随后利用显微镜进行观察拍照。番红染色可以明确氨基葡聚糖合成情况；甲苯胺蓝染色可以明确蛋白多糖合成情况。 　　1.3.3免疫荧光检测 当细胞的80%贴合于盖玻片后，在超净的工作台上放置一24孔的培养板，并取出贴有细胞的盖玻片，使用PBS液进行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，进行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗细胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。后加如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的二抗（sigma公司），37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板，0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。将所有盖玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min，后将清洗液弃去，加入4’，6-二脒基2-苯基吲哚（4’，6diamidino2-phenylindole，DAPI）进行染核，在室温条件下，进行5mi