超声辅助酶解人参总皂苷制备人参稀有皂苷Compound K研究.docVIP

超声辅助酶解人参总皂苷制备人参稀有皂苷Compound K研究 　　[收稿日期] 2014-02-21 　　[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目（2008BAI51B03）；国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室开放基金课题（2011NDDCM01002） 　　[通信作者] *贾晓斌，Tel/Fax：（025）E-mail：jiaxiaobinpharmacy@126.com 　　[作者简介] 于兆慧，硕士研究生，Tel：（025E-mail：yuzhaohui0415@126.com 　　[摘要] 该实验采用超声辅助酶解人参总皂苷以制备人参稀有皂苷Compound K。以转化率为指标，通过单因素考察超声功率、超声时间等超声预处理因素和pH、温度、底物浓度、酶用量、反应时间等酶解因素对转化率的影响，并应用响应面法试验优化制备工艺；采用MS，/1H，13C-NMR鉴定酶解产物。结果表明，超声辅助酶解反应的最适条件为超声功率250 W，超声时间15 min，酶解pH 5.5，酶解温度50 ℃，酶解时间36 h，酶用量-底物4∶5，底物质量浓度1.0 g?L-1；反应产物相对分子质量622.4，核磁图谱证实产物为人参稀有皂苷Compound K。在此条件下，以人参总皂苷计，人参稀有皂苷Compound K转化率为6.91%。该工艺反应条件温和，转化率较高，工艺简单可靠，适合工业化生产。 　　[关键词] 人参总皂苷；人参稀有皂苷Compound K；超声辅助；酶解；响应面法 　　人参稀有皂苷Compound K（CK）是五加科人参属植物人参的一种二醇型稀有人参皂苷，被世界各个国家广泛用于疾病的预防和治疗[1]。近年来研究发现，人参稀有皂苷CK在抗肿瘤、抗糖尿病、神经保护、抗衰老及抗炎等方面都具有明显的作用[2-8]。但CK在植物中的含量较低，单纯分离提取难以满足应用需求[9]。大量研究表明，人参二醇型皂苷在人参总皂苷中含量较高，且人参皂苷二醇组可以通过生物转化得到CK[10-12]，因此可以通过酶解的方法得到CK。生物酶解技术具有选择性高、反应条件温和、转化率高、分离纯化容易、对环境无污染及成本低廉等优点[13]，近年来在中药活性成分制备中已经具有了一定的研究价值。以蜗牛酶等水解中药提取物及中药单体成分中的糖苷键，可制备具有较高活性的低级苷或苷元[14-15]。本文研究超声辅助酶解人参总皂苷，利用超声波的空化效应、热效应和机械振动等作用[16]，促使底物与酶充分结合，从而提高酶解转化率。另外，本文采用蜗牛酶酶解人参总皂苷制备CK，大大降低实验成本，更利于工业化生产。因此，本实验对人参稀有皂苷CK的规模化制备具有重要的理论意义，并在一定程度上为CK 的产业化提供了实验基础。 　　1 材料 　　Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国 Agilent公司）；UV-2201型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；SK8210 HP型功率可调超声波清洗机（南京以马内利仪器设备有限公司）；Mettler AL204 1/10万天平（梅特勒-托利多仪器有限公司） ；精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；瑞士Bruker（AV 300）核磁共振仪，溶剂为氘代DMSO。 　　人参总皂苷（南京泽朗医药科技有限公司）；人参皂苷Re（中国食品药品检定研究院）；人参稀有皂苷Compund K （自制，纯度98%）；蜗牛酶（北京拜尔迪生物技术有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 人参总皂苷的含量测定 　　2.1.1 标准曲线制备[17] 精密称定人参皂苷Re对照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取人参皂苷Re对照品溶液10，20，30，40，50 μL分别置10 mL带塞试管中，将试管置于冰水浴中，分别加入40，30，20，10，0 μL甲醇后，再加入85%香草醛乙醇溶液0.5 mL ，77%硫酸5.0 mL，摇匀，混合物置60 ℃恒温水浴中加热10 min后，立即在冰水中冷却15 min，并在另一试管中加甲醇50 μL，加随行试剂，作为空白对照，显色溶液在（546±1） nm波长处测定吸收值，求得回归方程Y=0.004 1X +0.017 2，R2=0.999 9。 　　2.1.2 人参总皂苷的含量测定 取人参总皂苷提取物10 mg，精密称定，按2.1.1项操作，测定吸光值，计算人参总皂苷的含量，结果平均质量分数为8.79 g?L-1，RSD 2.2%。 　　2.2 人参稀有皂苷CK转化率的测定 　　2.2.1 色谱条件 Z