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连接蛋白43在胎盘组织中表达及与妊娠糖尿病相关研究 　　[摘要] 目的 观察连接蛋白43（connexin43，Cx43）在妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）患者胎盘组织中的表达，探讨Cx43及其构成的缝隙连接细胞间通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）在GDM胎盘组织中的作用。 方法 应用免疫组织化学法和Western blotting法检测GDM未治疗组（18例）、GDM治疗组（22例）和正常妊娠组（12例）胎盘组织中Cx43的定位和表达。 结果 免疫组织化学染色显示Cx43表达在滋养细胞的细胞浆及细胞膜。GDM未治疗组Cx43阳性颗粒主要集中在细胞浆中，且明显减少。GDM未治疗组Cx43蛋白水平明显低于其他两组（P0.05）。结论 Cx43在GDM未治疗组的滋养细胞低表达，提示滋养细胞间GJIC异常，导致GDM胎盘滋养细胞间融合、分化异常， 可能与GDM的不良妊娠有关。 　　[关键词] 妊娠糖尿病；胎盘；连接蛋白43 　　[中图分类号] R714.25 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）14-0045-03 　　妊娠糖尿病（gestational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠首次发生和发现的不同程度的糖代谢异常，包括妊娠前已经存在但被漏诊的孕前糖尿病者以及孕期伴随发生的糖耐量异常者[1]。缝隙连接（gap junction，GJ）和细胞缝隙连接通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）可以调控细胞增殖、细胞凋亡，参与细胞的生长抑制和转化[2]。Cx43是连接蛋白基因家族中分布最广、研究最多的一个连接蛋白。目前国内外文献中鲜有关于Cx在GDM胎盘中表达情况的研究报道。本研究通过检测Cx43在GDM孕妇胎盘中的表达，探讨Cx43及其构成的GJIC对GDM胎盘发育的影响，为GDM的发病机制提供新的理论根据。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 　　选择2011年7月～2012年6月于潍坊市中医院产科住院分娩的妇女，均排除孕前有糖尿病病史。参考2010年美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）的诊断标准[3]将患者分为三组，GDM未治疗组18例，GDM治疗组22例，正常妊娠妇女12例，三组孕妇年龄、分娩孕周比较，差异无统计学意义（P0.05）。三组孕妇均无烟酒嗜好，既往无高血压、血液病、肾脏疾病、代谢性疾病等病史。 　　1.2 方法 　　1.2.1标本采集 三组孕妇均于胎盘娩出后胎盘称重，直视下选取胎盘母面中央带与中间带组织（避开钙化， 机化灶），将其分为两部分：一部分切成约2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小块组织，用4%福尔马林固定，做石蜡切片；另一部分切成约0.5 cm3的小块，置于DEPC处理过的冻存管中，标记后放入-70℃冰箱低温保存备用。 　　1.2.2 免疫组织化学染色 试剂来源：兔抗人Cx43多克隆抗体（1∶1000美国，Zyned），SP免疫组化染色试剂盒（北京中山生物技术公司），DAB显示试剂盒（武汉博士德公司），APES粘片剂（北京中山生物技术公司）。免疫组化方法按试剂盒说明书进行。 　　1.2.3 Western blotting法检测胎盘组织中Cx43蛋白的表达 提取胎盘绒毛组织蛋白，用考马斯亮兰法测定蛋白质浓度。制作12%的分离胶和5%的积层胶，每泳道上样量20 μL，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h，加兔抗人Cx43多克隆抗体（1∶300 美国，Zyned） 4℃冰箱孵育过夜，TBST溶液摇床漂洗膜3次，每次15min。HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1000 美国Zymed 公司） 室温孵育2 h，同法洗膜3次，ECL发光试剂盒显影、X线片感光后显影定影，清水冲净晾干。应用BiospectrumAC 凝胶成像分析系统扫描分析。 　　1.3 结果判断 　　1.3.1 Cx43的阳性判断及分级标准 每张切片随机观察10个不重复的高倍（400×）视野，每个视野中根据滋养细胞的阳性细胞占观察同类细胞总数的百分率分为：阴性（-）：阳性细胞75%（3分）。细胞染色强度评分：阴性（0分）；浅黄色为弱阳性+（1分）；棕黄色为阳性++（2分）；细胞呈棕褐色为强阳性（+++）（3分）。Cx43评分=细胞染色率评分+细胞染色强度评分。0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。 　　1.3.2 Western blotting结果判定 应用BiospectrumAC