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透明质酸制备及其应用进展 　　摘要:本文综述了透明质酸的发现,存在部位以及目前其化学结构、生产制备方法、分离纯化方法及其在化妆品、临床、医药以及保健品等方面的应用进展。 　　关键词:透明质酸;制备方法;应用 　　 　　前言 　　透明质酸(hyaluronic acid、HA)又名玻尿酸,是一种酸性黏多糖,广泛存在于生物体的结缔组织中。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质,此后,人们对透明质酸开展了全面、深入的研究,逐渐清楚了透明质酸以其独特的分子结构在机体内显示出多种重要的生理功能,如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。 　　一、透明质酸的结构 　　透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构。分子式:(C14H20NNaO11)n,结构式如图: 　　 　　 　　二、透明质酸的制备方法 　　(一)动物组织提取法 　　制备透明质酸的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等,主要工艺过程包括提取、除杂和分级分离。从动物组织中提取透明质酸的一般过程如下:先将组织匀浆,再用水和稀盐溶液提取;提取用氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵沉淀;将所得的沉淀溶解除渣后,用2~3倍乙醇沉淀所得粗品。纯化可用乙醇或季铵盐进行反复沉淀处理,或采用酶解、超滤、离子交换等技术进一步除杂质及蛋白质。不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的差别。鸡冠中脂肪成分少,透明质酸含量高,容易绞碎,经丙酮脱脂后可直接用蒸馏水反复提取3次或40~50℃热提,透明质酸含量高达0.47%。脐带脂肪含量较鸡冠高,可用稀碱溶液(pH8)60℃热提数次,或用水―氯仿溶液(20∶1)提取并用等体积氯仿洗涤提取液进一步脱脂,脐带透明质酸产量约为0.2%[1]。眼玻璃体透明质酸的提取多用NaCl溶液(0.1~1M),收率为0.64-2.4%。猪皮中含脂肪较多,且韧性很大,不易绞碎,一般用NaOH溶液37℃保温使猪皮液化后用50%的乙醇调中性,猪皮透明质酸得率为0.7%。 　　动物组织提取法是当今生产透明质酸最主要的方法,但存在浓度不高、效率低、成本高、原料来源受限制等缺点。随着透明质酸应用范围的不断扩大,该方法已不能满足医药和化妆品生产的需求,必将逐渐被发酵法所取代。 　　(二)微生物发酵法 　　利用微生物发酵生成透明质酸的含量和数量主要取决于三个方面:一是菌种的筛选;二是培养基的选配及发酵工艺的优化;三是分离提纯。生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点,是今后研究开发的方向。 　　1.菌种的筛选。目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等[2]。为使透明质酸不被酶所分解,提高透明质酸的产量,可在发酵培养基中添加透明质酸酶抑制剂,实际生产中更常用的方法是对原始菌种进行一定的诱变处理,以得到适应性强、生命力旺盛、透明质酸产量高的安全菌株,NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)是较有效的化学诱变剂[3]。 　　2.培养基的选配及发酵工艺的优化。目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机盐等,其中酵母浸膏最常用。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物,最常用的是葡萄糖,还有磷酸盐、硫酸盐等无机盐。此外,为了获得高分子量的透明质酸,培养基中不能含有促使透明质酸降解的金属离子,如铁离子、铜离子,也不能加入自由基消除剂。 　　透明质酸发酵有需氧发酵和厌氧发酵,有氧发酵一般产率高且分子量高。在透明质酸发酵过程中,pH值一般控制在6.0~8.5范围内,低于6.0或高于8.5都会影响菌体生长,降低产率。温度通常为37℃,在不同发酵阶段采用不同的溶氧量,也可提高透明质酸的产率。此外,发酵液黏度可直观反映出透明质酸产率的高低,透明质酸的假塑性在高剪切速率作用下使溶液黏度下降,减轻传质的影响,高搅拌速率能显著提高透明质酸的分子量,但过高的速度会降低透明质酸的分子量,通常控制在100~800r/min之间。发酵液中加入少量尿嘧啶、谷氨酰胺和天冬氨酸,或加入溶菌酶,也能提高透明质酸产量。 　　3.透明质酸的分离纯化。分离纯化的主要目的是获得纯度较高的透明质酸,目前国内外一般以葡萄糖醛酸含量表示透明质酸的纯度,保健品及化妆品中透明质酸的葡萄糖醛酸含量为35%~45%,药用级别为42%~48%[4]。针对透明质酸发酵液的特性,分离纯化方法很多,在不同阶段分离纯化技术也不尽相同,但总体上可概括为如下流程:发酵液→预处理→分离(初步纯化)→纯化→干燥→成品。 　　(1)预处理。预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺,通过预处理可以杀灭透明质酸酶,减少透明质酸分子量的降低。常