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重组凝乳酶摇瓶发酵条件初步优化研究 　　摘 要:凝乳酶是一种酸性蛋白酶,用作动物饲料添加剂,可提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率,促进其生长。本试验研究了由毕赤酵母胞外表达多拷微小毛霉凝乳酶的摇瓶发酵条件。确定最佳表达条件为:甲醇每24 h添加1.0%,无氨基酵母氮源培养基(YNB)添加1.5%,采用pH 6.0的磷酸缓冲液,诱导120 h,在此条件下,重组凝乳酶的产量可达6 500 IU/ml。 　　关键词:凝乳酶;发酵条件;毕赤酵母 　　中图分类号:S816.79 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2009)12-0081-04 　　 　　凝乳酶(EC3.4.23.4)是一种酸性蛋白酶,能促进蛋白质凝结,用作动物饲料添加剂,可提高动物特别是幼龄动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率,促进其生长[1]。幼龄动物的消化系统发育还不完善,对饲料中营养的消化吸收率较低。提高饲料中蛋白类的利用效率,不仅能够节约饲料资源,降低养殖成本,而且能够降低动物粪便的氨氮排放,减轻集约化饲养对环境的污染[2]。 　　巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种比较理想的真核微生物表达系统,是用于表达重组蛋白的标准工具之一,近年发展和应用较多[3]。Pichia pastoris具有与真核生物极其相似的分泌途径和很强的真核蛋白质修饰功能,其自身分泌的蛋白质很少且易于高密度发酵,因此在表达和分离纯化异源蛋白质等方面具有很强的优势。但巴斯德毕赤酵母表达系统也会出现分泌蛋白聚合、降解等现象,从而降低蛋白的生物活性和产量[4]。此外,酵母细胞的生理状态也会严重影响其产酶活性,培养基的pH和甲醇、无氨基酵母氮源培养基(YNB)等营养物质浓度,对细胞的代谢状态会产生很大影响。本研究室成功地将微小毛霉凝乳酶在毕赤酵母中表达[5]。本试验对重组凝乳酶发酵培养基的pH值、甲醇和YNB浓度,以及接种比例等发酵条件进行了优化,提高了重组凝乳酶的产量。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　菌种:具有12拷贝基因的整合重组毕赤酵母菌PIC9K-mcp-03。 　　培养基:BMGY/BMMY培养基:取酵母提取物10 g,蛋白胨20 g,溶于700 ml去离子水中,高压灭菌20 min,冷却至室温,加入1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)100 ml、10×YNB 100 ml、500×B 2 ml、10×GY 100 ml(若制备BMMY,用100 ml 10×M代替10×GY),4℃保存备用(如无特殊说明,均采用上述条件,改变其中某项发酵条件时,其它项目不变)。1 000 ml三角瓶中加入100 ml培养基,于29℃ 170 r/min振荡培养5 d,每24 h补加甲醇1次。 　　1.2 方法 　　1.2.1 甲醇和YNB添加量对发酵液的影响 改变BMMY培养基中甲醇(0～3%)和YNB(0～4%)的添加量,其它条件不变,培养120 h,测定发酵液OD600 nm和发酵上清液酶活力。 　　1.2.2 接种量对重组凝乳酶产量的影响 改变BMMY培养基的接种量,选择不同体积的BMGY培养获得的菌体细胞,加入BMMY培养基中培养120 h,测定发酵液OD600 nm和发酵上清液酶活力。 　　1.2.3 BMMY培养基的初始pH值对重组凝乳酶产量的影响 改变BMMY培养基中所含磷酸缓冲液的pH值,分别调至pH 4.0～7.0,培养120 h,测定发酵液OD600 nm和发酵上清液酶活力。 　　1.2.4 菌体浓度的计算方法 将发酵液离心,菌体沉淀以蒸馏水重悬,经适当稀释后,测定并计算菌体悬浊液在600 nm的OD值。 　　1.2.5 酶活测定采用Arima方法[7] 适当稀释的上清液0.5 ml 35℃保温5 min,加入到35℃预保温10 min的5 ml 10%脱脂牛乳中,计时至管壁出现颗粒。记录凝乳时间(T)。酶活定义:在一定温度下(35℃),40 min凝乳1 ml牛乳的酶量为一个酶活单位。 　　凝乳酶活力(U)=[(5×2400)/(0.5×T)]×n,其中:T为凝乳时间,n为稀释倍数。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1 甲醇和YNB添加量对重组凝乳酶产量的影响 　　甲醇和YNB在培养基中起提供营养的作用,甲醇除了是发酵培养基的碳源,还是外源蛋白表达的诱导物,其浓度对重组凝乳酶的表达有一定的影响,随着甲醇浓度的增加重组凝乳酶的表达量也增加。而YNB除了作为培养基的氮源,还含有维生素和多种无机盐类。但二者在较高浓度下,又对发酵有抑制作用,且高浓度的甲醇对酵母菌也有毒害作用,甲醇经代谢生成甲醛和甲酸,甲醛可与带有羟基、巯基、氨基基团的分子发生亲核加成反