酿酒酵母组蛋白H3K56A突变菌株构建及其对细胞生长影响.docVIP

酿酒酵母组蛋白H3K56A突变菌株构建及其对细胞生长影响 　　摘要：组蛋白修饰，例如甲基化、乙酰化等修饰对基因表达和细胞生长至关重要。为揭示组蛋白H3第56位赖氨酸（K）修饰对酵母细胞生长的重要性，构建H3K56定点突变为丙氨酸（A）的组蛋白突变株H3K56A，并对其在高温、高盐等条件下的生长状况进行初步检测。根据酵母同源重组的原理，采用两步替换法构建H3K56A突变菌株，用分光光度法测定突变菌株的生长曲线，并分别在高盐、高温条件下检测突变体的表型。结果表明，酿酒酵母组蛋白H3K56A突变菌株构建成功，其生长曲线与野生型无明显差异；H3K56A突变株对高温、高盐条件均较敏感，且在高盐条件下，菌体生长缓慢、菌落偏小，表明组蛋白H3K56位点的修饰可能与酿酒酵母抗高盐、高温机制有关。 　　关键词：酿酒酵母；H3K56A突变菌；组蛋白修饰；两步替换法；同源重组；高盐环境；高温环境；抗逆机制 　　中图分类号： S188文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0077-05 　　收稿日期：2015-11-02 　　基金项目：国家自然科学基金（编号31260274）；内蒙古自然科学基金（编号：2015MS0334）。 　　作者简介：薛涛涛（1990―），女，山西临县人，硕士研究生，主要从事表观遗传学研究。E-mail：xuetaotao196485@163.com。 　　通信作者：赵秀娟，博士，教授，主要从事表观遗传学研究。E-mail：zhaoxiujuan@。 　　核小体是真核生物细胞内染色质的基本组成单位，它由147 bp的DNA缠绕核心组蛋白八聚体形成[1]，组蛋白H1与2个核小体之间有40～60 bp的连接DNA以稳定核小体的结构[2]。组蛋白八聚体具有球状的三维结构，而蛋白质氨基端则游离在三维球形的表面，游离氨基端的氨基酸残基可以被共价修饰[3]。在酿酒酵母中，编码核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4的基因都有2个拷贝，主要的核心组蛋白基因组成4个基因座，每个基因座包含2个组蛋白基因，这2个基因共用1个中心启动子并以不同的方向进行转录。编码组蛋白H3、H4的2个基因分别为HHTI-HHF1、HHT2-HHF2，分别位于Ⅱ号、XIV号染色体上[4]，在基因组中这2个拷贝只要有1个存在，便可维持细胞的正常生存[5]。组蛋白H2A、H2B的2个基因座分别为HTA1-HTBI、HTA2-HTB2，它们编码几乎相同的组蛋白H2A、H2B[6]。与组蛋白H3/H4不同的是基因座HTA1-HTBI对于细胞的生存是必需的，但HTA2-HTB2却不是。组蛋白上能发生共价修饰的氨基酸残基称为修饰位点，组蛋白修饰主要发生在组蛋白的N-末端残基上[7]。常见的修饰种类包括组蛋白乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化，以及研究较少的小泛素相关修饰物（small ubiquitin-related modifier，简称SUMO）化、生物素化等[8]。其中赖氨酸、精氨酸的甲基化，丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，赖氨酸的乙酰化、泛素化、SUMO化在酵母核心组蛋白中都被检测出来，而且这些修饰大多数都是可逆的[9]。近年来研究表明，组蛋白修饰在调控基因表达和细胞生长等生命活动中起重要的调控作用。 　　通过组蛋白翻译后修饰的染色质的表观遗传学变异对于环境因素诱导引起的基因转录的变化是很重要的。然而，在外界环境刺激下组蛋白修饰是如何被调控的目前还知之甚少，但是这种表观遗传调控途径对细胞适应与抵御外界不良环境却极为重要[10]。细胞外、细胞内的环境变化都会引起核染色质的变化，从而调控基因的表达，但是目前对这种调控机制的研究并不是很深[11]。外界环境变化信号如养分的缺失、盐离子胁迫和温度的变化等都会影响基因的表达及细胞的发育[12]。为研究组蛋白乙酰化修饰对细胞生长的影响，并探讨组蛋白修饰在酿酒酵母应对外界环境压力时所起的作用，本研究以酿酒酵母为材料，构建H3K56突变为丙氨酸（A）的组蛋白突变菌株，对其生长曲线进行测定，并在高盐、高温条件下与其他位点修饰突变菌株的生长状况进行比较。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株与质粒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741：MATa ura3Δ0 hisΔ0 leu2Δ0 met15Δ0；质粒pAG25由内蒙古科技大学基因工程实验室保存。组蛋白H3基因突变质粒pBB6-Hhf2-hht2K56A由戴俊彪实验室提供。 　　1.1.2试剂、酶与引物卡那霉素、鲑鱼精DNA，购自北京索来宝科技有限公司；诺尔斯菌素，购自北京启维益成科技有限公司；乙酸锂，购自美国MYM生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，购自TaKaRa；