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酿酒酵母基因工程菌构建及工艺优化研究进展 　　【摘要】酿酒酵母是合成天然产物的重要宿主菌，但在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、基因表达可控的代谢途径并获得高产菌株仍然是代谢工程和合成生物学中的难点，笔者系统介绍了目前酿酒酵母工程菌的构建及发酵条件优化的研究进展为其代谢与合成提供一定的参考。 　　【关键词】酿酒酵母；表达系统构建；发酵优化；合成生物学 　　【中图分类号】R714【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）18-0005-03 　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为酵母科酵母属，单细胞真核微生物，细胞形态多呈卵形或者球形，直径 5～10μm，以出芽生殖方式进行无性繁殖。其以研究背景清晰、代谢繁殖快、安全无毒、不致病等优点被广泛应用于食品与医疗卫生领域[1]。早在1996年已完成了对酿酒酵母的全基因组测序工作，其基因组包含16条染色体，全长为12068kb[2]。近年来，经国内外学者研究报道，酿酒酵母菌已经成为一种重要的模式生物被广泛的应用于基因工程、蛋白表达及遗传学分析等研究领域[3-4]，并围绕酵母菌开展了酵母基因敲除技术、酵母基因定位技术、酵母功能基因芯片技术、酿酒酵母双杂交技术等[5]。值得注意的是，由于酵母菌是最简单的真核生物，而利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系，从而起到异源表达或鉴定目的蛋白的作用[6-7]，所以越来越多的学者致力于通过构建酿酒酵母工程菌，建立酵母表达系统，并通过对发酵工艺的优化得到高产菌株，合成细胞工厂以发酵生产植物源天然产物[8]。笔者将着重介绍近年来构建的酿酒酵母基因工程菌在表达系统中的应用及酿酒酵母发酵工艺优化的研究进展。 　　1酿酒酵母表达系统的研究进展 　　目前构建酵母工程菌的途径主要有两种：一是在酵母底盘细胞中人工构建目的产物的合成途径，以实现快速大量的生产重要药用有效成分或其中间体；二是基于合成途径分支点的特点，通过抑制或下调目标途径的竞争途径以达到目的产物大量表达的方法。 　　11酿酒酵母基因工程菌合成途径的构建酿酒酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，培养条件简便，生长繁殖迅速，在表达基因工程产品时，可以大规模生产，且成本低廉，特别适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具[9]。 　　酿酒酵母自身存在甲羟戊酸途径，而该途径的中间代谢物2，3-氧化角鲨烯恰恰为萜类物质提供了关键的前体物质，被认为是萜类合成最适宜的底盘宿主[10]。戴住波等[11-12]已在酵母底盘细胞中人工构建了原人参二醇的合成途径，实现了从单糖到稀有人参皂苷CK的生物合成。王贝贝[13]通过对酿酒酵母甲羟戊酸途径中的限速酶过表达后，将成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素的合成基因整合至酵母中，最终获得了高产β-胡萝卜素的酵母工程菌。可见，构建代谢工程菌株，能快速大量的生产重要药用有效成分或其中间体，为濒危药材的保护和可持续利用提供应用基础[14]。林庭庭[15]等将拟南芥中的羽扇豆醇合成酶基因整合到三萜底盘菌株中，创建了羽扇豆醇酵母人工细胞工厂，并获得高产羽扇豆烷型三萜。王乐[16]在西洋参中以酿酒酵母菌作为受体菌分别构建了原人参二醇合成酶基因、原人参三醇合成酶基因与达玛烯二醇合成酶基因的异源表达载体，并将各异源表达载体分阶段转入同一酿酒酵母细胞中获得异源共表达工程菌，经检测其产量可达1385μg/g FW，表明酿酒酵母菌为药用植物中的皂苷异源代谢合成提供了天然的表达系统，也为通过代谢工程手段实现皂苷的异源工业化生产提供了研究思路。 　　12酿酒酵母基因工程菌竞争途径的调控当外源途径在酿酒酵母底盘细胞中成功组合、表达后，目的产物的合成依然还受酵母内源代谢途径的干扰，因此对于酵母内源竞争途径的调控显得十分重要。 　　张根林[10]对β-香树脂醇的研究报道中指出，除了存在MVA途径下游的FPP、鲨烯分支代谢外，至少还存在两个竞争代谢分支，一个是维持细胞正常生长必需的甾醇合成途径，一个是胞质乙酰辅酶A的合成与代谢途径。所以张根林在酿酒酵母中构建了β-香树脂醇的合成途径后，通过下调竞争β-香树脂醇合成的内源甾醇和乙酰辅酶A的代谢分流，用“推拉式”措施优化使得β-香树脂醇的产量大幅提高。谢文平[17]构建一种基于类胡萝素颜色的启动子强度表征系统，用于酿酒酵母中不同强度启动子的表征，其中通过弱启动子对竞争性代谢支路下调，以实现类胡萝卜素的高产。 　　在异源宿主进行目的产物合成时，为提高目标途径的代谢通量，增加前体物质的产量也是关键之一。徐国强[18]为了提高延胡索酸的产量，首先敲除调控乙醇合成途径中的关键基因，从而减少了乙醇的代谢通量获得合成