颈部不良应力对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达影响实验研究.docVIP

颈部不良应力对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达影响实验研究 　　[摘要] 目的 探讨颈部应力不良对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达（iNOS mRNA）的影响。 方法 选择SD大鼠60只，随机分为4组，对照组（A组，6只）：不做任何处理；假手术组（B组，18只）：切开皮肤，不损伤肌群；后深肌群损伤组（C组，18只）：切断部分颈部深肌群；后浅肌群损伤组（D组，18只）：切断部分颈部浅肌群。分别于术后1、3、6个月动态观察大鼠血清中IL-6、NO水平及颈部脊髓组织中iNOS mRNA表达及NOS活性的变化。 结果 ①IL-6水平：与A组比较，C组术后3、6个月及D组术后6个月IL-6水平明显升高（P 0.05）；与B组比较，C组与D组术后6个月IL-6水平均明显较高（P 0.05）。②NO水平：与A、B组比较，D组和C组术后6个月血清NO水平显著升高（P 0.05）。③iNOS mRNA：A、B组中未测得iNOS mRNA表达，C组及D组术后3、6个月iNOS mRNA表达显著升高（P 0.05）。④NOS活性：术后1个月，C组NOS活性较A、B组显著升高（P 0.01），D组NOS活性较A组显著升高（P 0.05）；术后3、6个月，C、D组NOS活性较A、B组差异明显（P 0.05）。 结论 颈部不良应力可引起颈脊髓慢性损伤。 　　[关键词] 颈部应力不良；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；基因表达 　　[中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（c）-0025-04 　　对于颈椎病的病因学研究，国内外学者认为主要以颈椎间盘退变为基础[1-2]，但近年来，颈部肌肉的作用越来越受到学者的关注[3-7]。研究显示，颈椎周围肌群是维系颈椎关节稳定和功能的动力系统，在颈推病发生发展中发挥了重要作用[8-9]。一氧化氮及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在中枢神经系统慢性损伤中发挥着不容忽视的作用[10-11]。本研究基于以上研究基础，通过建立颈部应力不良的SD大鼠实验模型，动态观察颈部应力不良后颈脊髓组织中iNOS的变化，探讨肌肉力量不平衡在颈椎病发病中的机制，进一步为颈椎病的临床治疗提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物及造模 　　健康成年SD大鼠60只（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：43004700015），体重280～300 g，随机分为4组，对照组（A组，6只）：不做任何处理，作为参照；假手术组（B组，18只）：切开皮肤，不损伤肌群；后深肌群损伤组（C组，18只）：切断部分颈部夹肌、最长肌、颈髂肋肌、头半棘肌；后浅肌群损伤组（D组，18只）：切断部分颈斜方肌、头颈菱形肌。操作均在无菌条件下进行，术后给予青霉素40万单位肌注，2次/d，连续3 d，给予普通饲料饮食，分笼饲养[12]。 　　1.2 主要试剂 　　白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）ELISA试剂盒由上海西唐生物技术有限公司提供；E.Z.N.A.总RNA提取试剂盒（Omega）、SuperQuickRT cDNA第一链合成试剂盒以及2×Es Taq MasterMix（含染料）均为北京康为世纪生物科技有限公司生产；琼脂糖为西班牙BIOWEST公司生产；三氯甲烷、异丙醇等有机溶剂均为分析纯，由国药化学试剂有限公司生产；一氧化氮合酶（NOS）活性检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。 　　1.3 标本采集 　　分别于造模后1、3、6个月处死大鼠，处死前大鼠眼眶取血，分离血清，液氮速冻后做好标记，-70℃下保存。剪下颈椎，采集脊髓标本约100 mg放置冻存管中，做好标记，液氮速冻后转存于-70℃冰箱。 　　1.4 IL-6、NO含量测定 　　采用ELISA法测定血清IL-6、NO含量，均根据试剂盒说明操作。 　　1.5 iNOS mRNA检测 　　1.5.1 引物合成 PCR扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的引物采用PAGE法进行纯化。GAPDH引物扩增产物条带大小为148 bp，iNOS引物扩增产物条带大小为398 bp。引物如下：GAPDH：P1 5-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3，P2 5-GACTCCACGACATACTCAGCA-3；iNOS：P1 5-CA CAGTCTTGGTGAAAGCG-3，P2 5-GGTGAGACAG TTTCTGGTCG-3。 　　1.5.2 组织总RNA提取及纯度鉴定[13] 从超低温冰箱中取出标本15 mg左右于碾?j中，剪刀剪碎，并加入液氮碾磨，充分碾磨后加入700 μL含有2%巯基乙醇的TRK溶液，震荡裂解细胞；把裂解液加到RNA Homogenizer 离心柱中，