香蕉腺苷酸核糖基化作用因子1基因克隆及序列结构分析.docVIP

香蕉腺苷酸核糖基化作用因子1基因克隆及序列结构分析 　　摘要：Arf(ADP-ribosylation factors)作为小G蛋白家族中的一类，在植物细胞的胞内运输中起着重要的作用。从采后2d的香蕉(Musa accuminataL.AAA group)果实cDNA文库中筛选到一条Arf基因，命名为MaArfl。序列分析表明，MoArfl在植物中是高度保守的。与水稻、苜蓿、马铃薯、小麦和拟南芥等物种中Arf基因的相似性都超过95％。并且MoArfl分别在24-31(序列为GLDAAGKT，Alf蛋白P结构域)，67-71(序列为DVGGQ，G’结构域)，126-130(序列为NKODL，G结构域)的氨基酸处也具有保守的GTP结合结构域。根据已获得的cDNA序列设计引物，研究又获得了该基因的基因组序列。对其结构分析发现，该序列全长1998bp，由5个外显子和4个内含子组成。内含子序列中存在大量的重复序列，并且在第4个内含子中有一个完整的开放阅读框。推测这些序列可能参与基因的表达调控，也可能与RNA水平上的可变剪接有关。 　　关键词：香蕉(MusaaccuminataL.AAA group)；MaArfl；cDNA；基因组序列 　　中图分类号：S668.1 　　文献标识码：A 　　文章编号：1009-9980(2010)03-404-06 　　 　　小G蛋白是一类区别于异三聚体G蛋白的单体鸟核苷酸结合蛋白。由于分子量较小(约为21～30ku)而得名。小G蛋白一般被分为5个家族，包括Ras、Rab、Ran、Rho和AIf。它们作为信号转导中重要的分子开关，进化相当保守，与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用，产生细胞功能的多样性。Ran，Rab和Arf3个家族负责调控真核细胞内与生命物质运输有关的细胞活动。其中，Ran调节核孔介导的RNA和蛋白质的运输：Rab控制特殊囊泡的运输：而Arf则与分泌系统中的囊泡出芽有关。 　　Arf(ADP-ribosylation factors)最初是在哺乳动物的细胞内发现的，它可以激活霍乱毒素的ADP-核糖基转移酶。近年来，在植物中发现了越来越多的Arf家族基因，Arf在植物体内以活性和非活性2种状态存在，当它在GTP酶激活蛋白(GTPase-acti-vating protein)的催化下与GTP结合时处于活性状态，可以参与胞内一系列的信号传递等生命活动。而在鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange fac-tor，GEFs)的催化下，它选择性地结合GDP进入非活性状态。研究发现，Arf在生物体内这种GTP-结合状态的循环改变，使其在植物的细胞极性生长和生长素极性运输调节中起着重要的作用。 　　我们利用香蕉采后2d的果实eDNA为驱动子，采后0d的果实eDNA为检测子。进行抑制差减杂交(substract hybrid，SSH)，筛选到一批在香蕉果实成熟早期上调表达的基因。其中一个398 bp片段经blast分析后发现可能为Arf家族成员。研究对MaArf1全长eDNA和基因组序列的克隆、基因结构进行分析，为探索该基因在香蕉果实成熟过程中所具有的功能奠定基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　1.1.1　植物材料　以中国热带农业科学院香蕉种植园(海南，澄迈)开花后100-120d的香蕉(M.acumintaL.AAA group cv.Baxi)为试材，选取发育正常的果-梳，采下后将其分为单果指。这些材料经1‰的次氯酸钠溶液表面消毒后，在22℃恒温下晾干，48h后将果实组织切成块状经液氮冷冻后存于-80℃冰箱(即采后2d果实)。 　　1.1.2　试剂　Taq DNA Polymerase和DNA回收试剂盒购自博大公司(BioDev)，其他试剂均购自Siga-ma公司。测序由上海生工公司完成。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1　香蕉果实总RNA的获得和cDNA第1链的合成 　　根据Wan等的方法提取采后2d的果实(包括果皮和果肉组织)的总RNA，根据Clonetech提供的SMART RACE eDNA Amplification Kit的说明书，将10ixg总RNA反转录为单链eDNA。 　　 　　1.2.2　MaArf eDNA的克隆　根据经SSH得到的398 bD的Arf同源片段分别设计5’和3’eDNA末端快速扩增(RACE)引物，以采后2d的香蕉果实cD-NA为模板，获得该基因的5’端和3’端的序列。5’RACE正向引物：TGATGGGCGAGCTlTAAGTCCTC(由SMART PCR cDNA Synthesis Kit提供的SMAR-THA寡核苷酸)；5’RACE反向引物GT