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黄瓜耐低氮相关基因克隆及表达分析 　　摘要：从黄瓜叶片中分离获得1个丙二烯氧化物环化酶基因，命名为[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]。该基因cDNA全长为753 bp，编码250个氨基酸，与甜瓜的丙二烯氧化物环化酶（AOC）序列同源性最高。通过荧光定量PCR（qRT-PCR）分析发现，[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]在低氮胁迫条件下只有在耐低氮黄瓜品系D0328中的表达量明显上调，在耐低氮能力弱的黄瓜品系D0422中的表达量并无明显变化。研究结果可为黄瓜耐低氮的基因功能研究提供理论依据。 　　关键词：黄瓜；耐低氮；基因；克隆；表达分析 　　中图分类号：Q786 文献标志码：A 　　文章编号：1002-1302（2017）04-0026-04 　　氮素由于在植物生长发育中有着不可或缺的作用，因此一直被广泛关注和研究。黄瓜（Cucumis sativus L.）作为一种喜硝态氮的蔬菜作物，对于氮素的需求也是毋庸置疑的。近几年来，生产者在盲目追求黄瓜产量的同时，过度施用氮肥的现象十分严重，造成的环境污染、黄瓜产品质量下降等后果也十分严峻[1-2]。因此，有效提高黄瓜耐低氮能力、培育耐低氮黄瓜品种对于创造绿色农业、现代农业具有重要意义。随着黄瓜基因的测序完成，许多研究已经发展到了分子水平，鉴于其他模式植物如拟南芥等的研究，通过挖掘氮素相关基因，利用基因工程手段提高植物的氮素代谢能力是研究黄瓜耐低氮的重要手段之一[3]。何红梅等对低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因CsCDPK进行了克隆、表达分析及遗传转化，也对谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黄瓜硝酸盐转运蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等进行了克隆与表达分析[4-6]，证明通过转录水平找到黄瓜耐低氮相关基因是可行的。丙二烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因是茉莉酸合成的重要酶基因，目前已经在多种作物中被克隆，如番茄[7]、拟南芥[8]、大豆[9]等。尽管这些AOC基因来自不同的植物，但是它们都对生物、非生物胁迫具有类似的响应。例如，麻疯树JcAOC可响应盐胁迫、低温胁迫[10]；喜树AOC基因的过表达可提高烟草对盐胁迫、低温胁迫的耐受性[11]；将大豆[WTBX][STBX]GmAO[WTBZ][STBZ]基因导入烟草可提高转基因植株的抗氧化胁迫能力，而[WTBX][STBX]GmAOC1[WTBZ][STBZ]则提高了烟草的耐盐性[9]。但是，关于黄瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因对低氮胁迫的响应还未见报道。 　　本研究对黄瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因进行分离，获得该基因的全?LcDNA序列，并阐述该基因的蛋白结构及系统进化情况，同时研究该基因在耐低氮能力不同的2个黄瓜品系中的表达模式。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验材料为前期筛选出的2份黄瓜品系：耐低氮能力强的D0328、耐低氮能力弱的D0422[12]，由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提供。 　　1.2菌株与试剂 　　大肠杆菌DH5α菌株、pEASY-T1克隆载体、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和Taq DNA聚合酶，购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；TRIzol，购自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix荧光定量试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司（TOYOBO）；其他生化试剂均为进口或国产分析纯产品。基因测序由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。 　　1.3方法 　　1.3.1植物培养将D0328、D0422种子浸种催芽后，在人工气候室中进行播种培养，光―暗周期16 h―8 h，昼―夜温度26 ℃―18 ℃，空气相对湿度保持在65%～70%之间，使用全蛭石为基质，浇灌营养液栽培。待其子叶展平时，分别用含低氮（3 mmol/L NO3-）、正常氮（14 mmol/L NO3-）的营养液进行处理，基础营养液配方：1.512 mmol/L NaH2PO4?2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4?12H2O，1.5 mmol/L MgSO4?7H2O，4 mmol/L Ca（NO3）2?4H2O，6 mmol/L KNO3，8.6 μmol/L C10H12FeN2NaO8?3H2O，10.3 μmol/L MnSO4，1 μmol/L CuSO4?5H2O，30 μmol/L H3BO3，24 nmol/L Na6Mo7O24?4H2O，