黄酮与溶菌酶相互作用强度衰减―基质辅助激光解吸离子化―质谱研究.docVIP

黄酮与溶菌酶相互作用强度衰减―基质辅助激光解吸离子化―质谱研究 　　摘要 建立了黄酮与溶菌酶相互作用研究的强度衰减-基质辅助激光解吸离子化-质谱（Intensity fading matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，IF-MALDI-MS）分析方法。在优化的基质DHB条件下，分别研究了木犀草素、染料木素、芹菜素、槲皮素和大豆黄素与溶菌酶相互作用，比较了溶菌酶加入前后黄酮的相对丰度的变化，并通过竞争实验的方法研究了5种黄酮与溶菌酶结合的亲和性大小。结果表明，5种黄酮与溶菌酶均存在相互作用，亲和性强弱为：木犀草素芹菜素，染料木素槲皮素大豆黄素。结合5种黄酮的结构特征，讨论了黄酮的结构及其与溶菌酶亲和性的关系，发现C5位和C3′位的羟基有利于黄酮与溶菌酶的结合，C3位的羟基不利于黄酮与溶菌酶的结合。本方法具有简便，快速，高效等优点，也可以应用于其它天然产物与蛋白质的相互作用的研究。 　　关键词 黄酮； 溶菌酶； 相互作用； 基质辅助激光解吸离子化-质谱 　　2016-01-29收稿；2016-03-11接受 　　本文系吉林省科技发展计划项目（No. 201105032）资助 　　E-mail： cuimeng@ciac.ac.cn 　　1 引 言 　　黄酮是一类重要的天然产物，广泛存在于各种植物及植物制品中。很多研究报道了它们具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗血栓、抗菌和抗癌等生理活性[1～3]。而黄酮的诸多生理活性主要通过与体内的各种酶、受体、载体的结合而发挥作用[4～6]。溶菌酶是人体内的一种非特异性免疫蛋白，广泛存在于体液和血清中[7～10]。研究发现溶菌酶可以作为药物的载体，协助药物在体内的吸收和转运[11～13]。所以研究溶菌酶和黄酮的相互作用，不仅有助于了解黄酮的生理活性，更有助于了解黄酮在体内的吸收及代谢情况。 　　目前， 研究溶菌酶与黄酮相互作用的方法主要有紫外可见光谱、红外光谱、圆二色谱和荧光光谱等方法[14～17]。但是这些方法的灵敏度和分析通量等尚有不足。随着现代质谱的发展，质谱以其快速、灵敏、准确等特点在蛋白质与小分子配体研究中起着越来越重要的作用。但是有关黄酮与蛋白质相互作用的研究多局限于电喷雾质谱的方法，例如Chen等曾用电喷雾质谱研究了磷酰衍生化后的黄酮与溶菌酶的相互作用 [18，19]。2003年，Villanueva等[20]首次建立了蛋白质与小分子配体相互作用的强度衰减-基质辅助激光能吸电离-质谱研究方法，该方法主要是基于加入靶蛋白后，小分子配体的离子峰强度发生衰减以识别配体与蛋白质的相互作用。目前该方法已应用到蛋白质和小肽[21]或生物碱相互作用[22]以及配体筛选 [23]的研究中，而对于溶菌酶和黄酮相互作用的研究尚未见报道。本研究建立了黄酮和溶菌酶相互作用的强度衰减-基质辅助激光解吸离子化-质谱（IF-MALDI-MS）方法，不仅快速识别出与溶菌酶相互作用的黄酮化合物，还比较了不同的黄酮与溶菌酶的结合强弱。与电喷雾质谱方法相比，本方法不仅具有传统MALDI质谱方法的耐盐、分析速度快等优点，而且还能克服传统MALDI质谱分析中黄酮与溶菌酶复合物易解离等缺点。本方法不仅为研究其它天然产物与蛋白质的相互作用提供方法学参考，还可应用于与蛋白质相互作用的靶分子的快速筛选。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　MALDI-TOF MS：配有337 nm 脉冲N2激光的Voyager DE-STR仪器 （Applied Biosystems， Framingham， MA）。 　　溶菌酶（Sigma-Aldrich公司），使用前未做进一步的纯化。黄酮：木犀草素、染料木素、芹菜素、槲皮素、和大豆黄素（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）， 5种黄酮的结构如表1所示。 三氮乙酰葡糖胺Tri-N-acetylglucosamine （NAG3，纯度≥98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）； 醋酸铵（分析纯）、棉籽糖（Fluka公司）； 甲醇（HPLC级，Fisher Chemical公司）； MALDI基质：2，5-Dihydroxybenzoic acid （DHB）、Sinapinic acid （SA）、α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid （CHCA）、2，4，6-Trihydroxyacetophenone （THAP）、2，5-Dihydroxyacetophenone （DHAP）、Hyaluronan （HA）、3-Aminoquinoline （AQ）、3-Hydroxy picolinic acid （HPA）均购