黄芪对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用及其对细胞凋亡影响研究.docVIP

黄芪对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用及其对细胞凋亡影响研究 　　摘要】目的探讨黄芪对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡影响的可能机制。方法采用无创伤动脉夹夹闭双侧肾动脉建立肾脏缺血再灌注损伤大鼠模型方法， 将大鼠分为A组（缺血再灌注组）、B组（黄芪治疗组）和C组（正常对照组）， 观察三组大鼠肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、血浆超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、凋亡调控基因Bcl-2、 Bax的表达及肾脏细胞凋亡指数（AI）的变化。结果黄芪治疗组SOD水平显著性高于缺血再灌注组（P0.05）， MDA、BUN和Cr指标与缺血再灌注组比较， 显著降低（P0.05）。正常对照组Bcl-2、Bax表达极少， 缺血再灌注组Bcl-2、Bax表达均明显增强（Bcl-2：P0.05、Bax：P0.01）；黄芪治疗组较缺血再灌注组Bax表达明显下降（P0.05）， Bcl-2表达显著增强（P0.01）。黄芪治疗组凋亡指数显著低于缺血再灌注组（P0.05）。结论黄芪对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用， 可能是通过影响凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达以降低肾脏细胞凋亡指数实现的。 　　【关键词】黄芪；肾脏缺血；再灌注损伤；细胞凋亡；中医药细胞凋亡在临床上十分常见， 譬如器官移植排斥反应及器官缺血再灌注损伤都存在细胞凋亡。黄芪对心、脑缺血再灌注损伤具有一定保护作用， 但对肾缺血再灌注损伤是否具有保护作用及其凋亡影响的研究报道较少。本研究目的是观察黄芪注射液对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡影响， 探讨其可能机制， 为临床应用黄芪防治肾脏缺血再灌注损伤提供实验依据和理论基础。 　　1#8195；材料与方法 　　1. 1#8195；材料#8195；健康清洁级SD大鼠30只， 体质量（240±10）g， 购自青岛市动物实验中心。 　　1. 2#8195；药品与试剂#8195；尿素氮、肌酐、丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒均购自上海生物研究所， 黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产， 原位细胞凋亡（TUNEL）试剂盒、SP二抗免疫组化试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司。 　　1. 3#8195；方法模型制备将SD大鼠术前饲养1周， 手术前禁食6 h， 将???验动物随机分为三组（n=10）， A组为缺血再灌注组， B组为黄芪治疗组， C 组为正常对照组。A组从门静脉注入NS1.2 ml/100 g， 10 min后夹闭肾动脉， 当阻断45 min后去除肾动脉夹再灌注， 肉眼观察肾脏由暗红色变为鲜红色， 说明肾脏再灌注成功， 缝合切口， 24 h后采血；B组用黄芪针剂1.2 ml/100 g代替NS， 其余处理同再灌注组；C组从门静脉注入NS 1.2 ml/100 g， 但不夹闭肾动脉， 等暴露45 min后缝合切口。切口缝合后继续喂养24 h， 自由摄水， 进食。24 h后麻醉取血液标本， 行有关酶学和生化指标检测。切除大鼠肾脏， 用4%低聚甲醛溶液固定， 石蜡包埋并编号， 待做病理学检查。 　　1. 4#8195；检测指标及方法 　　1. 4. 1#8195；血清BUN、Cr、SOD、MDA测定#8195；采集各组的血液标本， 用生化分析仪测定各组血肌肝、尿素氮含量。血浆中的SOD测定用黄嘌呤氧化酶法， 血浆中的MDA测定用试剂盒说明书操作。 　　1. 4. 2#8195；肾组织切片制备#8195；将用4%低聚甲醛溶液固定， 石蜡包埋并编号的标本， 4 μm厚连续切片， 行HE染色观察。 　　1. 4. 3#8195；凋亡指数的检测#8195；利用TUNEL法检测细胞凋亡指数， 凋亡细胞镜下胞体缩小， 核膜皱缩， 染色不均匀， 细胞核中有棕黄色颗粒， 可见核固缩及核碎裂。每张切片在400倍镜下观察10个连续不重叠视野， 计数凋亡细胞数和细胞总数， 凋亡指数=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。 　　1. 4. 4#8195；Bcl-2蛋白表达#8195；用免疫组化SABC法测定Bcl-2蛋白表达。Bcl-2阳性表达为胞浆染色呈棕黄色， 而Bax蛋白阳性表达表现为胞浆染色黄褐色， 每张切片在400倍镜下观察10个连续不重叠视野， 后用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像免疫组化软件分析其平均灰度值， 可视为Bcl-2或Bax的相对含量。 　　1. 5#8195；统计学方法采用SPSS18.0软件统计数据。计量数据以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 计数资料采用χ2分析， P0.05表示差异有统计学意义。 　　2#8195；结果 　　2. 1#8195；血BUN、Cr、SOD、MDA的测定结果A组与C组比较， 前者术后BUN、Cr水平明显高于后者， 二者比较