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黄芪对谷氨酸损伤海马神经元保护作用 　　 　　摘要:目的观察黄芪对谷氨酸(Glu) 损伤海马神经元的保护作用。方法胚鼠原代培养海马神经元，以不同浓度的黄芪（100 g/L、200 g/L和400 g/L）干预24 h，加入125 μmol/L谷氨酸损伤海马神经元15 min。采用MTT法检测细胞活性；生化法测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH) 活力的变化；膜联蛋白VFITC(Annexin VFITC)和碘化吡啶(PI) 双标染色以及Hoechst 染色观察细胞凋亡情况。结果黄芪可明显改善谷氨酸损伤后细胞的活性，抑制谷氨酸损伤后培养液中LDH 的活力，降低谷氨酸引起的细胞凋亡率。结论黄芪具有明显的拮抗谷氨酸损伤海马神经元的作用。 　　关键词：黄芪；谷氨酸；海马神经元；细胞培养 　　 中图分类号：R329.2R285.5文献标识码：Adoi:10.3969/j.issn2014.06.049文章编号2014 　　 　　黄芪系豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，味甘，性微温，入脾肺二经。目前药理学研究发现，黄芪含有黄芪皂甙、异黄酮类化合物及硒元素，这些物质参与了机体的多种代谢过程，具有广泛的药理作用［1］。黄芪是传统中医治疗脑缺血的常用药物，临床疗效良好。但由于缺血性脑血管病的病理机制非常复杂，包括自由基损害、兴奋性氨基酸毒性、钙超载以及炎症反应等诸多方面。因此，黄芪在脑缺血中发挥保护作用的机制还有待于进一步研究。 　　谷氨酸(Glu) 是脑内主要的兴奋性氨基酸，参与了中枢神经系统多种信息的传递。在脑缺血后，谷氨酸的过度释放可产生神经兴奋性毒性，从而诱导神经细胞死亡［2］。本研究中在体外原代培养了大鼠海马神经元，通过观察黄芪对谷氨酸损伤后海马神经元的影响，进一步探讨黄芪对缺血性脑损伤的保护机制。从而为传统中药黄芪的临床应用提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料黄芪注射液(黑龙江珍宝岛制药公司，批号)；脑源性神经生长因子(BDNF，Sigma公司)；DMEM 培养基、Neurobasal 培养基(含2% B27) 和胰酶(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青有限公司)；L多聚赖氨酸和Hoechst 33342(Sigma公司)；谷氨酸和甘氨酸(BBI公司)；乳酸脱氢酶（LDH） 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CO2培养箱(NAPCO公司)；全自动酶??仪(BioTek公司)；台式冷冻离心机(Beckman 公司)。 　　1.2方法 　　1.2.1海马神经元的原代培养健康孕18 d～19 d SD 大鼠乙醚麻醉处死，无菌条件下取胎鼠脑，解剖显微镜下取出双侧海马，0.125%胰蛋白酶37 ℃酶解10 min后,吹打至细胞分散,调整到一定细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的细胞培养板。置于 　　1）为国家自然科学基金资助项目（No81171023）；上海市科委课题（No.11QA1400900）通入混合气体(含95% O2 和5% CO2)的37 ℃恒温培养箱内过夜。次日换成Neurobasal培养基置于5%CO2，饱和湿度,37 ℃培养箱培养8 d备用，每2 d～3 d 换一次培养基。培养8 d 后，以MAP2 单克隆一抗和含绿色荧光的二抗标记神经元，Hoechst 33342 标记细胞核进行免疫荧光细胞化学分析，海马神经元纯度达95%以上。 　　1.2.2谷氨酸损伤模型的建立丢去培养基，加入125 μmol/L谷氨酸(含1 μmol/L 甘氨酸) 100 μL，孵育15 min 后吸弃，轻轻洗去残留的谷氨酸，加入培养基继续培养。正常组细胞以不含谷氨酸的缓冲液进行干预处理。 　　1.2.3黄芪对原代培养大鼠海马神经元存活的影响原代培养大鼠海马神经元，接种入96孔板中，每孔接种100 μL，使每孔细胞数为105。8 d后，将细胞分为正常对照组、谷氨酸损伤组(阴性对照组)、BDNF组(阳性对照组)、黄芪100 g/L组、200 g/L组和400 g/L组。各给药组分别加入相应药物干预24 h后，以谷氨酸损伤神经元，并于损伤后的6 h、12 h、18 h、24 h加入MTT 检测各组细胞活性。每孔加入噻唑兰(5 g/L)20 μL，置37 ℃孵箱孵育4 h，小心吸净各孔的培养液后，每孔加入150 μL的DMSO。置振荡器振荡至紫色结晶完全溶解，酶联免疫检测仪选取490 nm波长，630校正参数，测定分光光度值。记录对照组及各实验组的分光光度值，明确黄芪对原代培养大鼠海马神经元存活的影响(以对照组存活率为100%作为基准)。 　　1.2.4黄芪对谷氨酸损伤海马神经元培养上清中LDH活力的影响每孔10