鸡体抗病毒蛋白基因荧光定量PCR检测方法建立和初步应用.docVIP

鸡体抗病毒蛋白基因荧光定量PCR检测方法建立和初步应用 　　摘要：为建立检测鸡干扰素诱生的3种抗病毒蛋白（IFIT5、PKR和OASL）基因表达水平的荧光定量PCR方法，并将其应用于实践，本研究设计和筛选了3个基因的特异性扩增引物，制备了各基因的质粒标准品，绘制了荧光定量PCR的标准曲线，并检测了该方法的灵敏度、重复性和特异性。结果表明所建立的方法敏感度高、特异性强、检测线性范围广、重复性好，应用该方法检测了新城疫病毒感染SPF鸡胚后相关基因的表达情况，发现在病毒感染后IFIT5、PKR与OASL基因的表达水平均迅速提高。 　　关键词：鸡；抗病毒蛋白；检测；荧光定量PCR 　　中图分类号：S851.34+7.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0119-05 　　当病毒感染动物机体时，病毒以其携带的病原相关分子模式（pathogen-related molecular pat-tem，PAMP）识别机体细胞的模式识别受体（pat-tem-recognition receptor，PRR），进而激活相应的配体，启动机体固有免疫通路的转导，诱导产生干扰素（Interferon，IFN）和促炎性细胞因子。干扰素并不直接作用于病毒，而是通过激活干扰素刺激基因（IFN stimulated genes，ISGs）的转录和表达，产生多种抗病毒蛋白（Antiviral protein，AVP）而发挥机体的抗病毒效应。目前发现的ISGs已超过300种。在ISGs表达产生的为数众多的抗病毒蛋白中，双链RNA依赖的蛋白激酶（Double-stranded RNA-dependent protein ki-nase，PKR）、2’，5’腺苷酸合成酶（2’，5’-Oligoadenylate synthetase，OAS）和IFIT（In-terferon induced proteins with tetratricopeptide re-peats）家族分子在机体抵抗多种病毒感染中发挥着十分重要的作用。 　　建立灵敏、快速的抗病毒蛋白定量检测方法，对于深入了解病毒的致病机制、研究开发新型疫苗和抗病毒药物均具有非常重要的意义。荧光定量PCR（Q-PCR）技术是目前对基因表达进行定量检测的金标准，被广泛应用于各种样品中基因mRNA水平的检测。其中SYBR Green I荧光染料法以其使用方便、成本低廉等优点而被广泛使用。本研究旨在建立检测鸡PKR、OASL和IFIT5基因转录水平的实时荧光定量PCR方法，并将其用于检测病毒感染后相应基因的表达变化，以验证所建立方法的实际应用效果。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　新城疫病毒（NDV）弱毒疫苗株LaSota、NDV分离株Duck/China/SD03/2009，由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存；9～11日龄SPF鸡胚，购买自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。 　　1.2 试剂 　　pUC57载体、DH5α感受态细胞、荧光定量PCR预混液（Master Mix）和缓冲液（Buffer），购自上海生物工程有限公司（Sangon）；Trizol、TE缓冲液、反转录试剂盒和高保真酶PCR试剂盒，In-vitrogen公司产品；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自Qiagen公司；IPTG（异丙基硫代-β-半孚L糖苷）、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和氨苄青霉素，购自宝生物工程（大连）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉，购自OXOID公司；其他试剂均为国产分析纯。 　　1.3 引物的设计 　　从GenBank下载鸡IFIT5、PKR、OASL的基因序列（登录号：XM_421662、NM_204487和NM_205041），作为引物设计的模板。利用PrimerPremier 5.0设计PCR扩增引物多对。选取β-actin基因作为内参基因，一并设计引物。 　　1.4 质粒标准品的制备 　　利用NDV弱毒疫苗株LaSota感染11日龄的SPF鸡胚，从而激活鸡胚固有免疫基因的转录表达。以Trizol法提取病毒感染24 h的鸡胚尿囊液的总RNA，使用随机引物法将RNA反转录为cD-NA。利用上述设计的引物，以cDNA为模板分别进行PCR，扩增3个基因的相应片段。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取产物条带单一、亮度高而且条带大小与预期一致者，用于胶回收。将回收产物与pUC57载体连接，转化人大肠杆菌DH5α感受态细胞，经细菌培养后挑取白色单菌落扩大培养，然后进行菌液PCR鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒菌液送上海生工生物公司测序验证。测序结果分别与各基因的参考序列进行比对，以确定插入片段正确与否。并据