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鱼配合饲料中氯霉素残留量检测方法 　　摘要：研究了一种相比于GB/T 21108-2007《饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法》前处理步骤相对简单的方法测定鱼配合饲料，采用内标法定量，添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg四个浓度，回收率在90.2%～119.9%。氯霉素在0.1～20.0 ng/mL范围内线性关系良好，R20.999，相对标准偏差（RSD）6%，满足GB/T 27404-2008以及GB/T 21108-2007对回收率和精密度的所有要求。通过计算得到方法检出限（LOD）为0.002 μg/kg，方法定量限（LOQ）为0.006 μg/kg。 　　关键词：氯霉素检测，鱼配合饲料，检测方法研究，液相色谱串联质谱法 　　氯霉素属广谱抗生素，它通过与核糖体的50S亚单位结合，而抑制细菌蛋白质的合成。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原体也有抑制作用。因其效高价廉，曾在水产、畜牧业中广为应用。但氯霉素有较强的毒副作用和毒性，长期应用可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害。目前检测饲料中氯霉素的方法有气相色谱-质谱法[1-3]、液相色谱-质谱法[4-6]和酶联免疫法[7-8]。本实验参考GB/T 20756-2006等方法[5-6，9-10]研究出一种前处理步骤相对简单的液相-质谱法用于检测鱼配合饲料，降低了不确定度，并且缩短了检测时间，提高了检测效率。 　　1材料与方法 　　1.1主要试剂 　　氯霉素标准品均购自Dr.Ehrenstorfer Gmb公司，纯度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）购自Dr.Ehrenstorfer GmbH Lot No.30417AC 100 μg/mL。乙酸乙酯，Fisher ，色谱纯；正己烷，沃凯，色谱纯；实验用水为Mili-Q制得的电导率18.2Ω的超纯水。 　　1.2主要仪器 　　IKA分析研磨机；湘仪离心机TDAA-WS；0.22 μm微孔滤膜；EYELA旋转蒸发仪；日立高速冷冻离心机 HITACHI CF16RXⅡ；HPLC system：Agilent 1200 series，Agilent 6410 LC/MS/MS Agilent6410a 串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent。 　　1.3试验部分 　　1.3.1标准溶液配制[9]准确称取10.00 g氯霉素，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶，得到100 μg/mL氯霉素标准储备液；准确吸取 1 mL氯霉素标准储备液乙腈定容至100 mL，得到1 μg/mL氯霉素标准中间液；准确吸取1 mL氯霉素标准中间液，纯水定容50 mL，得到20 ng/mL氯霉素标准工作液。 　　准确吸取100 μg/mL氘代氯霉素内标标准储备液 100 μL乙腈定容至10 mL，得到1 μg/mL氘代氯霉素内标标准中间液 ；准确吸取1 mL氘代氯霉素内标标准中间液纯水定容50 mL，得到20 ng/mL氘代氯霉素标准工作液。 　　1.3.2样品前处理鱼配合饲料样品用IKA分析研磨机磨成细粉，准确称取5.00 g±0.001 g于50 mL具塞离心管中，加入20 ng/mL氘代氯霉素250 μL，加入15 mL乙酸乙酯，混匀，振摇15 min，4 000r/min离心8 min，取出上清，再用15 mL乙酸乙酯重新提取一次，合并上清，45 ℃旋转蒸发至干，5 mL水溶解，10 mL正己烷除脂两次，静止分层，取下层水相12 000 r/min 4 ℃冷冻离心后过0.22 μm水相有机相串联滤膜，得到样品用于液相串联质谱仪器测定。 　　1.3.3液质联用仪分析条件[10] 　　1.3.3.1色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent，进样量为20 μL；柱温30 ℃；流动相为A去离子水、B乙腈；梯度洗脱条件见表1。 　　1.3.3.2质谱条件采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，Capillary：4 000 V，多反应监测（MRM）方式检测，干燥气N2，干燥气温度350 ℃，雾化气压力35psi，优化质谱条件见表2，氯霉素及氘代氯霉素的MRM色谱图和其定性定量离子质谱图见图1、图2。 　　1.4线性范围、检出限和定量限 　　配制9个不同质量浓度的标准溶液，溶液中氯霉素为0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20