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鱼鳔膜为基质生物传感器测定葡萄糖研究 　　摘 要 以鱼鳔膜为基质固定葡萄糖氧化酶,偶联氧电极,构建了葡萄糖生物传感器,通过测定溶解氧浓度的变化定量测定葡萄糖。考察了酶浓度、pH值、缓冲液浓度对传感器的影响,优化了实验条件：即酶浓度为1 mg, pH 7.0,缓冲液浓度为100 mmol/L。此传感器具有较宽的线性范围（0.016～1.2 mmol/L）,较短的响应时间（70 s）,较低的检出限（8 mol/L）,良好的重复性（2.5%, n＝10）和重现性（1.2% , n＝3）,连续使用200次后响应信号能保持95%以上； 3个月后响应信号为初始值的88.5%。此传感器已成功应用于人血清中葡萄糖含量的测定,测定结果与市售试剂盒法获得的结果相一致。回收率为95.2%～106.3%。 　　关键词 葡萄糖传感器； 鱼鳔膜； 葡萄糖氧化酶 　　 　　1 引 言?? 　　葡萄糖的定量测定在临床医学、生物化学、食品科学等领域有极其重要的作用。健康人体中空腹血糖浓度的正常范围为3.89～5.83 mmol/L,血糖浓度持续偏高,是发生某些疾病征兆,如糖尿病、高血糖症等。葡萄糖的测定方法有色谱法、光谱法和毛细管电泳法等,而这些方法有的需要复杂的前处理过程,有的仪器设备成本高。生物传感器法由于具有检测速度快、选择性好、体积小、易操作等优点,得到了广泛应用。?? 　　生物传感器包括酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器等。在葡萄糖传感器的研究中,酶传感器研究最广,它基于葡萄糖氧化酶的催化氧化反应,反应式如下式： 　　葡萄糖（Glucose）＋Ｏ??２葡萄糖氧化酶Glucose oxidase葡萄糖酸（Glucose acid）＋2H??2O??2（1）?? 　　葡萄糖氧化酶的固定化是构建葡萄糖传感器的重要环节。固定酶的载体可采用无机材料、有机高分子膜及天然生物材料等。天然膜材料（鸡蛋膜、竹腔内膜、洋葱内膜等）具有生物相容性好、无毒等优点,已被用于固定葡萄糖氧化酶。但这些膜材料的机械强度差,限制了葡萄糖生物传感器的应用。?? 　　鱼鳔膜具有良好的透气性和透水性,价廉易得,机械强度高且韧性好,可以为酶的固定化提供优良的生物基质。本研究基于溶解氧电极,采用天然的生物材料鱼鳔膜和交联剂戊二醛、包埋剂壳聚糖,构建了新型的葡萄糖生物传感器。对影响因素进行了优化,建立了新型葡萄糖分析测试方法,并成功应用于血液中葡萄糖含量的测定。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂?? 　　Pasco CI-6542溶解氧传感器（15 cm ×10 cm × 5 cm, Pasco Scientific, Roseville, CA）； pHS-3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）; 恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）; TU1901紫外可见分光光度计（北京普析仪器公司）; L600低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。?? 　　葡萄糖氧化酶（酶活力为273 Units/mg,Sigma公司）; ??β-D??-葡萄糖（Acros Organics公司）; 壳聚糖（脱乙酰度75%～85%,Sigma公司）; 葡萄糖试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司）; 新鲜鱼鳔膜;Na??2HPO??4-NaH??2PO??4（pH 7.0）,Na??2HPO??4-NaOH和NaH??2PO??4-HCl缓冲溶液。血样由山西大学校医院提供,其它试剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水。 　　2.2 血样的处理?? 　　新鲜血样加入抗凝剂肝素后,以4000 r/min离心5 min,静置分层,用吸管将上清液吸出,置于另一试管中,加盖保存到4 ℃冰箱中备用。 　　2.3 酶膜的制备?? 　　取新鲜鱼鳔一个,依次用自来水和蒸馏水冲洗,在顶端处剪开一缺口,铺开置于洁净的表面皿中,小心截取一个直径为1.5 cm的圆形膜。在膜上滴加50 L 0.3%（w/V）壳聚糖溶液,15 min后滴加50 L 2.0%（w/V）葡萄糖氧化酶溶液, 晾至稍干后再滴加10 　　 L交联剂10%（V/V）戊二醛溶液,室温放置2 h,置于冰箱中冷藏过夜。用100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7）冲洗数次,以便将未固定的酶及多余的包埋剂和交联剂洗掉。制得的酶膜浸泡在100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7）中,置于4 ℃冰箱中保存备用。 　　2.4 测定方法?? 　　将制备好的酶膜紧贴于溶解氧电极的表面,即成酶电极,将此酶电极浸入5 mL 100 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7）中,在均匀搅拌条件下加入一系列葡萄糖标准溶液（0.05 mol/L）和待测溶液,用Workshop 500软件记录溶解氧浓度的下降值,从