分子生物学技术真核细胞DNA的-馆档网.DOC

馆档网 专业文档检索与下载 HYPERLINK / / 　　 本文档下载自HYPERLINK /馆档网，如果排版有问题，您也可以点击以下网址在线阅读： HYPERLINK /txt/322047.html /txt/322047.html 【实验技术方法】分子生物学技术(zt) 分子生物学技术真核细胞DNA的 ... 【实验技术方法】分子生物学技术(zt) 分子生物学技术 真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern 杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|Northern Blot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染 真核细胞DNA的制备与定量 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇 二、操作步骤 （一）材料处理 1．新鲜或冰冻组织处理：/txt/322047.html ar⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 ⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。 ⑷ 60°C水浴1-3hr。 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。 ⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。 ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。 ⑷ 50-55°C水浴1-2hr。 （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。 2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。 3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。 5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。 7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。 8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。 9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。 (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说 /txt/322047.html 明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。