干货根据分析方法的目的,高效地进行液相色谱方法开发之.PDFVIP

2018/9/3 药物分析之家 干货 | 根据分析方法的 目的 ，高效地进行液相色谱方法开发之几个基本概念 Bruce Lee 药物分析之家 7月5 日 HPLC技术应用范围十分广泛 ，包括食品、医药、化工等领域。其分离、分析的高效 ，快速 ，定量准确 ，分析方法容易转移等特点 ，成为新 药以及仿制药研发分析实验室不可或缺的一种基本仪器 。而药物研发过程 中 ，根据分析的 目的不 同 ，开发的液相分析方法亦多种多样 ，如 in-process-control ，impurity ，assay ，impurity indicating ，residual impurity ，genotoxic impurity control等等 。因此 ，需要针 对分析方法 目的的不 同 ，选择特定的出发点 ，高效且快速的对分析方法进行开发。 1.液相色谱系统有关基本概念 1.1 V0 ：死体积 ，其大小与仪器管路 （进样器之后到检测器之前 ），色谱柱 （未被固定相 占据的色谱柱体积 ），检测器流通池以及进样器之 后到检测器之前部分所有链接头处死体积有关 ，其 中只有色谱柱 内部分体积参与液 -固分配平衡 ，其余部分均会导致无益的峰扩展。对应与 色谱峰上的保留时间为死时间 （t ） ；且V =t ×F ，F为流速 。t 可以实际测定也可以通过估算得到 （实际测定使用尿嘧啶 ，估算可将色谱 0 0 0 0 图上第一个明显波动的保留时间计为t 或者通过V = （0.5Ld 2 ）/ F与0.1L/ F （仅应用于4.6 mm内径色谱柱 ）得到 ，第二种估算法一般小于 0 0 p 实际测定值 ，第一种估算法有时由于强极性不保留组分共流 出峰的峰扩展导致估算不准。但对于方法开发来说 ，估算方法的误差范围 ，完全 可以接受 ）。 Figure 1 典型 RP色谱图 1.2 V ：滞留体积 ，t ×F ，t 为流动相变化前沿赶上色谱柱 内组分的时间。其组成包括流动相泵混合器 出口到色谱柱入 口处的管路体积 ，各 d d d 接 口处的死体积 ，流动相 intial组成到达色谱柱入 口开始 ，至赶上溶质时流动相组成 ，这段时间内所流过的流动相体积。其大小将影响分析 方法 的有效转移 ，特别是对于 UPLC而言 ，一般地 ，早流 出组分色谱峰的保 留时间受到较大影 响 ，晚流 出组分色谱峰受到 的影 响较小 （以 RRT计量 ）。 Figure 2 V 对保留时间的影响 d /s/9yNjTvlWAuEYTIdCNjzWBg 1/4 2018/9/3 药物分析之家 Table 1 V 对保留时间的影响 d 严格来讲 ，滞留时间不仅与管路体积 ，各接头处体积有关 ，也与分析样品被保留能力以及梯度变化斜率直接相关 ，分析物被保留能力越弱、 梯度斜率越大 ，其被影响程度也就越大 （参照上表 中各组分峰的相对保留时间 ）。因此在不 同仪器之间进行方法转移的时候 ，需要重点考虑 滞留体积对不 同仪器之 间方法重现性的影 响。而在实际对V 测量时 ，并不考虑溶剂变化前沿到溶质段时间流动相流过的体积 （可结合梯度 d 分 离 以 及 Snyder 方 程 来 理 解 ） ， 因