第三章 沉淀法课件.ppt

3.2.4 选择性沉淀法 定义： 依据蛋白质、酶和核酸等生化成分对某些物理因素或化学因素（温度、pH和有机溶剂）的敏感性不同，而有选择性的使之变性沉淀，从而达到纯化有效成分的分离方法。 具体方法： A、表面活性剂或有机溶剂变性 B、利用对热的稳定性不同，加热破坏某些杂质，保留有效成分 例：黑曲霉发酵制备脂肪酶时。 40℃水浴，2.5小时，pH4.3可将90%以上的淀粉酶变性除去。 C、选择性酸碱变性 2.5%的三氯乙酸，可用于提取胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素C，目的除去大量的杂蛋白。 3.2.5 其他方法 A、非离子型聚合物（nonionic polymers） Polyethylene glycol 优点：条件温和、不易引起变性、沉淀较完全等。 原因：降低蛋白质间的水化度，增大蛋白质间的静电引力； PEG的空间排斥作用，使蛋白质分子被迫挤靠在一起而沉淀； B、聚电解质（polyelectrolytes） 酸性多糖、羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐等 机理：絮凝作用，在蛋白质分子间架桥，兼有盐析和降低水化度的作用； 适用领域：酶和食用蛋白的回收； C、多价金属离子（polyvalent metal ions） 优点：微量沉淀； 金属离子可通过交换树脂或EDTA除掉； 3.3 核酸的提取与沉淀分离 1、DNP/RNP的解聚 （1）去污剂 SDS、DOC、TritonX-100 、Tween40 作用：a、溶解细胞膜上的脂质与蛋白，破坏细胞膜； b、解聚核蛋白； c、SDS能与蛋白质结合 形成复合物，使蛋白质变性沉淀 ，随后加入醋酸钾，使复合物变 为溶解度更小的钾盐形式，使沉 淀更加完全； （2）有机溶剂 苯酚、氯仿（chloroform）等 a、使蛋白质失去水合状态而变性； b、离心，一般水相在上，蛋白质沉淀在中间，有机相在底部； Membrane breaks, then releases organelles 破碎 chloroform 注：提取时有时使用氯仿﹕异戊醇=24 ﹕ 1 或酚﹕氯仿﹕异戊醇=25 ﹕24 ﹕1 因为： ⅰ、酚与水有一定程度的互溶，约10%-15%的水溶解在 酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA； ⅱ、氯仿的变性作用不如酚好，但氯仿与水相不混溶； ⅲ、抽提时要充分混溶或剧烈振荡，为此易产生气泡 阻止分子间的相互作用，异戊醇降低分子表面张力 ，减少气泡产生； （3）蛋白水解酶 温和、避免剪切破坏核酸； Protein K , Protein E 因含有DNase，如果提取DNA时，要在80℃处理5分钟或37℃温育0.5-1小时； 2、多糖类杂质的消除 （1）多糖 Ⅰ、动植物的材料处理 Ⅱ、提取液中的多糖类杂质用选择沉淀法加以除去； 异丙醇、CTAB，适用于酸性多糖的除去。 Ⅲ、还可用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理,然后离心,多糖位于中部,核酸存在于上层的乙二醇甲醚中。 （2）DNA与RNA的分离 Ⅰ、salting-out 原理：DNA1-2mol/L的氯化钠，溶解度较大，在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度极小；而RNA在0.14mol/L氯化钠溶液中溶解度较大； Ⅱ、酶水解法 市售的RNase也会混入DNase，采用100℃处理15分钟， DNase失活，RNA不受影响； 市售的DNase也会混入 RNase，在Ca2+存在时，加入蛋白酶K或加碘乙酸钠（ RNase 的活性中心烷化处理），RNase失活，DNA不受影响； 3、核酸沉淀 （1）有机溶剂 Ⅰ、乙醇 Ⅱ、异丙醇 （2）PEG PEG的浓度与DNA片段的分子质量成反比 ＞1.65Kb DNA，用5%的PEG沉淀 1.2Kb DNA，用6%的PEG沉淀 0.6Kb DNA，用7%的PEG沉淀 （3）CTAB 适用于多糖含量较高的DNA/RNA溶液 1%的CTAB+0.35mol/L的NaCl CTA-核酸沉淀物，多糖留在溶液中 0.1mol/LNaAc-70%乙醇洗涤，就能将CTA+从沉淀中置换出来，和乙酸生成可溶 性的十六烷基三甲基乙酸铵，离心后存在于上清，核酸生成钠盐，70%的乙醇中仍为沉淀物。 So much for this chapter! 酵素分析方法是蛋白質分析的最重要主流。 雖然本節的主題是蛋白質分析，但主題及對象都是酵素，事實上兩